应用小干扰RNA研究Erβ在青春期椎体线性生长中的作用

摘要

目的:构建成ERβ特异性打靶的基因沉默载体,并将其包装为逆转录病毒颗粒。分别转染目的细胞和小鼠,构建ERβ基因沉默的细胞模型和动物模型。在细胞水平上,研究ERβ对成骨细胞的增殖能力的调控作用和细胞因子OPG和RANKL的分泌和表达的调控作用。在动物水平的上,初步研究ERβ在青春期脊柱椎体线性生长中的作用,及其对部分主要细胞因子的调控作用。
　　方法:登陆genbank网站检索小鼠ERβ cDNA序列的2个转录本。利用Ambion公司的“SiRNA Target Finder”软件设计针对ERβmRNA的siRNA序列,构建成ERβ特异性打靶的基因沉默载体。检测并筛选对ERβ沉默效果最佳者包装成为病毒颗粒。以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1为对象,设立3组,其中2个组分别转染ERβ RNAi载体和阴性对照ERLRNAi载体,第3组为空白对照组。3组在相同条件下培养。然后,绘制各组细胞的生长曲线;分析各组细胞的细胞周期;检测各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;检测各组细胞形成钙结节;检测各组细胞中OPG、RANKL表达的变化。取昆明小鼠36只,其中雌性和雄性各18只,分别随机分为3组,分别为ERβ RNAi组、空白对照组和阴性对照组。制备ERβ沉默动物模型。分别于动物模型制作当天、2周、4周和6周测量小鼠身长、体重。6周后,制作各组小鼠椎体组织切片分别进行HE染色和Masson三色染色观察椎体骺板软骨细胞层的变化及骨小梁密度的差异;通过TUNEL检测椎体内细胞凋亡情况的差异;采用免疫组化的方法进行检测细胞因子OPG和RANKL的表达差异。用SPSS16.0软件分析各组差异的显著性。
　　结果:所设计的2条RNAi打靶序列均在小鼠ERβ两个基因转录本中存在同源序列,但在小鼠其它基因组中未发现同源组序,可以同时打靶ERβ的两个转录本。构建的重组质粒经质粒测序证明重组质粒DNA中含有shRNA序列。经过转染细胞检测显示,两个Erβ沉默组PCR扩增片段的电泳条带明显较阴性对照组和空白对照组减弱,且ERβRNAi-1条带比ERβRNAi-2条带的灰度比小,均有显著性差异,P＜0.05。对Erβ沉默效果较好的ERβRNAi-1质粒进行病毒包装后,测得其病毒滴度T为106.67±025 IU/ml。绘制的生长曲线显示ERβ RNAi组成骨细胞的增殖能力明显高于空白对照组和阴性对照组。流式细胞仪检测显示ERβ RNAi组G1期细胞百分率明显少于其它两组,而S期和G2期细胞明显百分率明显高于其它两组。RNAi组的ALP活性较其它两组高;成骨结节较其它两组的数量较多,体积较大。Realtime-PCR检测分析显示,RNAi组OPG的Ct值较其它两组小;RANKL的Ct值较其它两组大。差异均有显著性,P＜0.05。在雌性小鼠组中,ERβ RNAi组小鼠身长增加值高于空白对照组和阴性对照组;体重增加值却小于其它两组,有显著性差异,P＜0.05。制作椎体组织切片,经检测显示,ERβ RNAi组小鼠椎体骺板下的骨小梁较其它两组密集,而骺板下软骨增殖层较薄,而且椎体生长板软骨层结构紊乱;椎体骺板下纽胞凋亡数量较其它两组多;椎体骺板下细胞因子OPG阳性数量较其它两组多;细胞因子RANKL阳性数量则较其它两组少。差异均有显著性,P＜0.05。在雄性小鼠组中,上述备项检测结果均无显著性差异,P＞0.05。
　　结论:构建的ERβ RNAi逆转录病毒载体能够有效沉默ERβ的表达。在细胞和动物水平上,ERβ沉默后,成骨细胞的增殖能力增强,OPG表达增强,RANKL表达减弱,ALP活性增加,骨形成量增加。因此,我们可以反向推断,ERβ的表达可能直接和/或间接抑制软骨细胞向成骨细胞的转化,抑制成骨细胞的增殖、分化和凋亡的过程。通过激活OPG/RANK/RANKL信号通路中多种细胞因子,主要包括OPG和RANKL等,间接抑制破骨细胞的凋亡,进而促进骨吸收,抑制脊柱椎体的线性生长。