日本血吸虫感染小鼠结肠黏膜内虫卵死活鉴别及抗原检测的研究

摘要

第一章Sj虫卵内抗氧化酶检测及用于鉴别虫卵死活的研究
　　 [目的]检测日本血吸虫（Sj）不同发育程度虫卵内抗氧化酶水平，分析其是否可作为判别宿主体内血吸虫卵死与活的标志物。
　　 [方法]采用3，3-二甲基联苯胺盐酸盐(DAB)+H2O2的底物系统作为抗氧化酶检测方法对完整Sj虫卵进行染色观察，并探索其染色条件。建立Sj感染后第50d和90d有活虫体寄生的小鼠模型与其治后30d和90d无活虫的小鼠模型。用抗氧化酶染色最佳条件对各模型组小鼠肝肠组织分离出的游离虫卵作生化检测，比较观察其对未成熟卵、成熟卵、近期变性卵和远期变性卵的染色结果，并依据其显色程度与其分布情况评价抗氧化酶水平，分析其用于判别Sj虫卵死与活的可能性。用超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX、)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒测定分析虫卵内抗氧化酶类型及其水平。
　　 [结果]与未做染色的虫卵比，DAB底物系统加入完整游离活卵中经室温震动反应30min时，所呈现的深棕黄色的阳性反差最明显;DAB底物系统加入经100℃水浴处理30min完整游离活卵作检测时，未见呈显色反应;用DAB底物系统对Sj感染50d、90d及治后30d和90d的模型鼠肝肠来源虫卵染色的阳性率分别为92.34％、46.03％、13.68％和0.00％。阳性反应程度分析显示:未成熟虫卵普遍呈深棕黄色;成熟卵多呈深黄色，分布于毛蚴体部;近期变性卵中部分有显色反应，且多为未成熟卵;远期变性卵和卵壳均无显色反应。SOD、GSH-PX、POD和CAT校正浓度的各自构成比在未成熟中分别为64.1％、28.4％、3.6％和3.9％，在成熟虫卵中分别为72.7％、21.8％、2.0％和3.6％。
　　 [结论]证明Sj活虫卵内均富含抗氧化酶成分，且以SOD和GSH-PX抗氧化酶类为主。在未成熟卵中含量高，且随着虫卵发育成熟至死亡而逐渐减低，并可作为鉴别游离Sj完整虫卵死与活的标志物。
　　 第二章Sj感染鼠结肠黏膜内虫卵游离的方法探索
　　 [目的]探索游离组织内虫卵的方法，改善活检组织内虫卵做抗氧化酶染色鉴别其死活的效果。
　　 [方法]采用压片、剪切、超声、化学(5％NaOH)消化、酶（0.5％胰蛋白酶和1％胃蛋白酶）消化共6种方法对小鼠肠黏膜模拟活检组织进行处理，观察虫卵游离出组织及用DAB染色的效果。
　　 [结果]在6种处理方法中，可使虫卵较好地游离出组织和获得较理想抗氧化酶染色效果的是胰蛋白酶消化法。压片和剪切法对虫卵游离效果差。超声法可使部分虫卵破裂和丢失。NaOH和胃蛋白酶二者消化法主要影响抗氧化酶染色效果。
　　 [结论]胰蛋白酶消化法可使肠黏膜内大部分虫卵游离，并获得良好的抗氧化酶染色效果，但仍需进一步解决全部虫卵游离出组织的问题。
　　 第三章Sj感染鼠结肠黏膜内虫卵分泌抗原检测的研究
　　 [目的]检测感染鼠结肠黏膜内血吸虫卵内的毛蚴分泌渗出到宿主组织的可溶性抗原，为研发一种可弥补活检肠黏膜查见虫卵不足的诊断方法提供实验依据。
　　 [方法]制备兔抗和鼠抗血吸虫卵多克隆抗体，探索酶免疫组化和荧光免疫组化检测感染鼠肠黏膜内血吸虫卵抗原的可行性，建立间接夹心ELISA法，探索好最佳条件后，对正常鼠、感染后90d鼠、治后1M鼠和治后3M鼠的结肠黏膜，取模拟活检组织块大小，经镜下分出有虫卵和无虫卵的组织后，又分超声和匀浆两法处理的上清液分别进行比较检测。依据OD值≥阴性参考对照的2.1倍被确定为阳性;用间接酶免疫组化法对各组小鼠结肠石蜡切片标本比较检测，观察到黏膜组织中出现棕黄色被判为阳性。依据两法检出的阳性率做出统计分析及效果评价。
　　 [结果]酶免疫组化法未获得阳性结果;荧光免疫组化法检测到组织中虫卵抗原，但效果不理想;用间接夹心ELISA法检测结果显示:对经超声处理的含虫卵黏膜和不含虫卵黏膜内的抗原阳性检出率在A组（感染90d小鼠组）分别为58.97％和60.00％，在B组（感染50d后治疗1M小鼠组）分别为37.50％和25.00％，在C组（感染50d后治疗3M小鼠组）分别为13.89％和0.00％，在D组（正常鼠对照）均未见出阳性;对经匀浆处理的含虫卵黏膜和不含虫卵黏膜内的抗原阳性检出率在A组分别为45.00％和00.0％，在B组、C组和 D组均未见出阳性。
　　 [结论]采用间接夹心ELISA法检测感染鼠结肠黏膜内虫卵抗原具有良好的诊断和考核疗效价值，但对检出的敏感性还有待于提高。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

第一章 Sj虫卵内抗氧化酶检测及用于鉴别死活虫卵的研究

1 材料与方法

1．1 寄生虫与实验动物来源

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 日本血吸虫完整虫卵标本的来源与收集

1．5 对Sj虫卵抗氧化酶染色方法的建立

1．6 DAB染色最佳反应条件探索

1．7 DAB对Sj不同发育期活卵和变性卵的染色效果分析

1．8 Sj成熟卵和未成熟卵内抗氧化酶的类型与其活性水平检测

1．9 统计学分析

2 结果

2．1 完整的游离虫卵染色的条件

2．2 DAB对完整的游离虫卵染色效果分析

2．3 血吸虫成虫及虫卵中各种抗氧化酶水平的结果比较

3 讨论

第二章 Sj感染鼠肠黏膜组织内血吸虫卵游离的方法探索

1 材料与方法

1．1 实验标本与来源

1．2 主要仪器和试剂(盒)

1．3 虫卵组织来源及收集方法

1．4 不同方法游离肠粘膜虫卵及其染色效果的方法探索

1．5 平行检测未治疗鼠和治疗鼠的结肠黏膜内虫卵

1．6 统计学分析

2 结果

2．1 肠黏膜内虫卵在不同方法处理后的虫卵游离及染色结果观察

2．2 对感染未治疗鼠和治疗鼠的结肠黏膜内虫卵检测结果分析

3 讨论

第三章 Sj感染鼠结肠黏膜内虫卵抗原检测的研究

1 材料与方法

1．1 寄生虫来源和实验动物

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 血吸虫虫卵的制备与收集

1．5 SEA免疫兔血清的制备及抗体纯化

1．6 结肠黏膜组织内血吸虫卵抗原检测的方法

1．7 检测标本的制备和间接ELISA方法建立

1．8 统计学分析

2 结果

2．1 酶免疫组化方法的检测结果

2．2 荧光免疫组化检测结果

2．3 ELISA法检测结果分析

3 讨论

结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间主要研究成果