应用细胞色素氧化酶亚基Ⅰ鉴定蝇科常见嗜尸性蝇种

摘要

背景:
　　 法医昆虫学(Forensic entomology)是法医学和节肢动物科学在广泛领域结合并相互影响的一门新型交叉边缘性学科，应用范围上涉及刑事、民事、行政案件，为法医实际检案提供技术帮助。主要研究方法是对在尸体内、尸体表面或尸体附近采集到的昆虫标本，进行检验、鉴定、分类后，明确昆虫种类或确定某一昆虫生长发育状态，结合该昆虫在尸体上的生态群落演替及生活习性，帮助法医完成死亡时间（postmortem interval，PMI）推断。在应用尸体上昆虫群落演替规律解决相关法医学问题的前提是鉴定昆虫的种类。
　　 机体死后不久，就会有大量嗜尸性蝇类到达并产卵，因此，测定尸体上嗜尸性蝇类的种类及其蛹的发育龄期是估计死亡时间(PMI)的重要昆虫学资料。然而昆虫种类繁多，只有经过专门训练的专业人员才能掌握某类群的形态学鉴别要点。利用形态学特征鉴定蝇类的方法不能得到很好的普及，也给法医工作者日常实际检案带来很大障碍。
　　 近年发展起来的分子生物学技术便很好的解决了这一难题，本研究通过运用自行设计的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)引物，从基因水平探索昆虫种类的鉴别。使昆虫种类鉴定方法更为准确和科学。
　　 目的:
　　 应用272bp的细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)的基因片段对蝇科常见嗜尸性蝇种进行种类鉴定，为建立地区嗜尸性昆虫基因库积累数据，为蝇科嗜尸性蝇种在实践中进行死亡时间推断奠定基础。
　　 方法:
　　 2009-2011年在湖南省及周边省份应用家兔尸体诱捕嗜尸性蝇科成虫，与本教研室前期(2007-2008)捕获的嗜尸性蝇科样本进行汇总、挑选，邀请湖南省农业大学昆虫学专家对挑选出的样本进行形态学鉴定。利用十六烷基三甲溴化铵(CTAB)法提取样本DNA，琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。
　　 Epoendorf梯度PCR仪进行扩增，PCR胶回收试剂盒纯化。纯化产物送往华大基因（武汉）进行序列测性;MEGA4软件包进行序列分析及构建系统发育树。
　　 结果:
　　 通过对DNA COⅠ片段进行PCR扩增和测序的方法，能有效检测出嗜尸性蝇科样本的基因序列，利用MEGA4.0软件构建系统发育树。得出与形态学鉴定一致的种类，鉴定出4属5种蝇类的种属关系:家蝇属中家蝇;黑蝇属中厚环黑蝇、斑踱黑蝇;腐蝇属中厩腐蝇;螫蝇属中厩螫蝇。
　　 结论:
　　 DNA序列分析具有快速、简便和精确的特点，是目前分析进化及系统发育研究中有效、可靠的方法，分子鉴定是对形态学鉴定方法上的一个有效补充，因此，mtDNA的272bp COⅠ片段是鉴定蝇科常见嗜尸性蝇种的一个有效分子标记。

目录

声明

摘要

技术路线

缩略词表

前言

第一章 材料与方法

1．1 主要实验试剂和仪器

1．1．1 主要实验试剂

1．1．2 主要试剂配制

1．1．3 主要仪器

1．2 样本来源和处理

1．3 实验方法与步骤

1．3．1 DNA提取

1．3．2 DNA质量浓度和纯度检测

1．3．3 琼脂糖电泳检测DNA提取效果

1．3．4 PCR引物设计及PCR扩增

1．3．5 PCR扩增产物纯化及测序

1．3．6 序列分析和系统发育树的构建

第二章 结果

2．1 形态学鉴定结果

2．2 琼脂糖电泳检测mtDNA提取效果

2．3 COI DNA基因测序结果

2．4 种蝇科序列登录NCBI数据库搜索结果

2．5 COI序列分析和系统发育树构建结果

2．6 通过COIDNA基因序列获得的遗传距离

2．6．1 种间差异

2．6．2 种内差异

2．6．3 两两种类种间差异百分比

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果