去神经支配对侧支血管生长的作用及其机制的研究

摘要

目的:探讨去神经支配对大鼠/兔后肢股动脉结扎诱导的侧支血管生长的影响及其可能的机制，丰富和完善侧支血管生长机制的理论，为缺血性疾病的治疗寻找促侧支血管生长新的途径。
　　 方法:动物模型:成年SD健康大鼠52只和8只新西兰大白兔，切断右侧坐骨神经，存活1W后重新对动物进行麻醉，在腹股沟的深面暴露股动脉三角区域，将股动脉分离，在股深动脉的稍下方采用双结扎法结扎股动脉，同时在右侧股深动脉发出处用10％的苯酚溶液涂擦将结扎股动脉近侧端的分支神经损毁，然后再切断右侧股神经，左侧仅行单纯股动脉结扎，建立大鼠/兔后肢股动脉结扎和后肢股动脉结扎结合坐骨神经和股神经切除诱导侧支血管生长模型;单纯去神经组除不结扎股动脉外，其余步骤同上;
　　 实验方法及检测指标:第一部分:研究去神经支配对大鼠后肢缺血诱导侧支血管生长的影响。上述32只大鼠动物模型分别存活1W和8W（分别为侧支血管生长活跃期和成熟期），采用血管造影、组织学以及共聚焦免疫荧光术，观察保留和去神经支配对大鼠后肢侧支血管生长的影响;
　　 第二部分:研究去神经支配对大鼠/兔后肢股动脉结扎诱导的侧支血管生长激活的影响。利用上述模型中的12只实验大鼠和8只实验新西兰大白兔，通过共聚焦免疫荧光术，观察去神经支配对大鼠/兔后肢侧支血管生长过程中与炎症密切相关的细胞因子如ICAM（细胞粘附分子）、VCAM（血管细胞粘附分子）、MCP-1（单核细胞趋化因子）和CD11b（单核/巨噬细胞标志物）以及Ki67（细胞增殖标志物）、Vimentin（外膜成纤维细胞和平滑肌合成表型标志物）、MMP-2（基质金属蛋白酶-2）和eNOS（一氧化氮合酶）等表达的影响;
　　 第三部分:研究神经对侧支血管生长的可能作用机制，主要从在体和离体两方面进行研究:①动物实验:观察去神经支配后神经分泌素(Secretoneurin，SN)在侧支血管生长中的表达变化;同时利用上述大鼠动物模型中的8只以10μg/d的SN剂量在大鼠股动脉结扎侧后肢股薄肌处进行局部注射，存活1W，通过共聚焦免疫荧光术，观察SN对侧支血管生长过程中细胞增殖和单核/巨噬细胞浸润的影响。②细胞培养:鉴于血管平滑肌细胞是侧支动脉血管的主要细胞以及在侧支血管靠近外膜处的平滑肌细胞表达VCAM和MCP-1等，故采用大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞体外培养，取5-6代细胞用于实验研究，平滑肌细胞经特异性的抗平滑肌细胞肌动蛋白(α-SM actin)抗体鉴定，分为正常对照组、1ng/ml SN组、10ng/ml SN组、100ng/ml SN实验组，SN作用24h后，运用MTT比色法检测不同浓度的SN对血管平滑肌细胞增殖活性的影响，并采用免疫印迹和免疫细胞化学法检测SN对血管平滑肌细胞表达VCAM-1（血管细胞粘附分子）和MCP-1（单核细胞趋化因子）的影响。
　　 结果:第一部分:单纯股动脉结扎侧，血管造影可见明显密集呈网状分布的侧支血管，组织学和共聚焦免疫荧光术可见血管壁各层结构发生重塑，生长的侧支血管管腔增大，管壁较薄，呈外向性生长方式的特征，且骨骼肌纤维形态完好，排列规则;股动脉结扎加去神经侧，侧支血管的数目虽然比正常增多，但明显少于单纯股动脉结扎侧;侧支血管管腔狭窄，管壁变厚，骨骼肌肌纤维出现降解，体积减少，肌间隙增宽。
　　 第二部分:去除神经支配后，侧支血管粘附分子ICAM和VCAM在血管内皮的表达下降不明显，但外膜和靠近外膜的中膜处VCAM和MCP-1的表达则明显降低，与此相对应单核/巨噬细胞（CD11b阳性细胞）的数目在血管壁明显减少;另外，和单纯股动脉结扎相比，在侧支血管生长活跃期外膜成纤维细胞的数目较少，MMP-2的表达较低，而在侧支血管成熟期成纤维细胞数目增加，但中膜Vimentin及eNOS的表达一直呈高水平。
　　 第三部分:①单纯股动脉结扎侧，SN免疫阳性神经纤维主要表达在侧支血管外膜，去除神经后SN的表达明显减少至消失;股动脉结扎+局部注射SN后，侧支血管细胞增殖的数目和单核/巨噬细胞的表达均明显增加。②用抗平滑肌细胞肌动蛋白的抗体对培养的血管平滑肌细胞的纯度进行鉴定，98％的细胞为α-SM actin免疫阳性细胞。MTT比色法发现不同浓度的SN作用后，血管平滑肌细胞的增殖活性均明显增强;免疫细胞化学和免疫印迹均显示SN能刺激血管平滑肌细胞VCAM和MCP-1的表达明显上调。
　　 结论:①在大鼠/兔后肢股动脉结扎诱导的侧支血管生长模型，去除神经支配后，侧支血管的数目减少，血管管壁增厚，管腔变窄呈内向性的生长方式，导致血流减少供血不足，造成骨骼肌的缺血和损害;②去神经支配导致血管壁特别是外膜SN和细胞因子(VCAM和MCP-1)的表达下降，单核细胞/巨噬细胞浸润下降以及外膜成纤维细胞的活性降低和MMP-2表达的减少，从而导致外膜的激活程度下降，细胞增殖降低，限制侧支血管外向性生长;③血管壁的神经可通过释放神经肽-神经分泌素参与血管壁炎症的形成从而调节侧支血管的生成，血管壁的神经还可通过释放的神经分泌素直接刺激平滑肌细胞的增殖以促进侧支血管的生长。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一部分 去神经支配对大鼠后肢股动脉结扎诱导的侧支血管生长的影响

1．1 材料和方法

1．1．1 实验动物

1．1．2 主要试剂和仪器

1．1．3 动物模型制作

1．1．4 血管造影

1．1．5 组织取材

1．1．6 HE染色

1．1．7 NF、Desmin、α-SM-actin和CX40的免疫荧光染色

1．1．8 结果观察和数据分析

1．2 实验结果

1．3 讨论

第二部分 去神经支配对大鼠/兔后肢股动脉结扎诱导的侧支血管生长激活的影响

2．1 材料和方法

2．1．1 动物模型制作与组织取材

2．1．2 主要试剂

2．1．3 免疫荧光染色

2．1．4 结果观察和数据分析

2．2 结果

2．3 讨论

第三部分 神经支配对侧支血管生长的作用机制—神经分泌素的作用及可能机制

3．1 材料和方法

3．1．1 实验动物和动物模型制备

3．1．2 实验主要试剂和仪器

3．1．3 主要溶液配制

3．1．4 SN的免疫荧光染色和局部注射SN后Ki67、CD11b的免疫荧光染色

3．1．5 成年大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞贴壁法原代培养和传代

3．1．6 大鼠血管平滑肌原代培养细胞的鉴定

3．1．7 实验分组

3．1．8 MTT比色法检测SN对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

3．1．9 SN处理后Ki67、VCAM和MCP-1的免疫荧光细胞化学染色

3．1．10 蛋白质免疫印迹

3．1．11 数据收集和统计学分析

3．2 实验结果

3．3 讨论

参考文献

结论

综述

致谢

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