成骨细胞矿化过程中microRNA表达谱分析及miR-93的功能研究

摘要

第一部分小鼠成骨细胞矿化过程中microRNA表达谱的分析
　　 目的:
　　 诱导小鼠成骨细胞矿化，研究小鼠成骨细胞矿化过程中microRNA表达谱的变化。
　　 方法:
　　 体外手术分离培养新生小鼠颅骨原代成骨细胞，使用β-甘油磷酸(β-glycerophosphate，β-GP)和抗坏血酸(ascorbic acid)诱导成骨细胞矿化，茜素红(Alizarin Red S)染色实验观察成骨细胞的矿化情况。建立了诱导小鼠原代颅骨成骨细胞矿化的细胞模型。应用miRNA微阵列技术，分析小鼠成骨细胞矿化过程中miRNA表达谱的变化。通过qRT-PCR方法验证表达明显变化的miRNA在小鼠成骨细胞矿化过程中的表达情况。选取表达显著降低的miR-93作为进一步的研究对象。
　　 结果:
　　 (1)采用体外手术分离法成功从小鼠颅骨分离出原代成骨细胞。
　　 (2)β-GP和抗坏血酸诱导小鼠成骨细胞培养至7天后，可见茜素红染色阳性的矿化结节形成。
　　 (3)用miRNA microarray芯片检测小鼠成骨细胞矿化化过程中miRNA表达谱变化，发现差异表达的miRNA中表达明显上调的有3个，分别是:mmu-miR-98，mmu-miR-130a，mmu-miR-210;表达明显下调的有6个，分别是:mmu-miR-93，mmu-miR-103，mmu-miR-92b，mmu-miR-674，mmu-miR-351，mmu-miR-24。以mmu-miR-93表达下调最为明显。
　　 (4)对差异表达最明显的miRNA进一步行实时定量RT-PCR验证，发现定量PCR结果与芯片结果一致，表明miRNA芯片结果是可靠的。
　　 结论:
　　 建立了诱导小鼠原代颅骨成骨细胞矿化的细胞模型。应用microRNA芯片发现小鼠成骨细胞矿化过程中，mmu-miR-98，mmu-miR-130a，mmu-miR-210表达明显上调，而mmu-miR-93，mmu-miR-103, mmu-miR-92b, mmu-miR-674, mmu-miR-351, mmu-miR-24表达明显下调。以mmu-miR-93表达下调最为显著。
　　 第二部分miR-93对成骨细胞矿化的功能研究
　　 目的:
　　 研究miR-93在小鼠成骨细胞矿化过程中的作用。
　　 方法:
　　 用β-GP和抗坏血酸诱导小鼠成骨细胞矿化，Northern印迹杂交检测miR-93在此过程中的表达模式。根据miR-93前体序列设计引物，用PAJ-U6-CMV-eGFP vector合成miR-93慢病毒稳定表达载体pre-miR-93。将pre-miR-93转染小鼠成骨细胞，构建pre-miR-93过表达细胞模型，加入β-GP和抗坏血酸诱导分化，Northern杂交检测miR-93表达变化，茜素红染色观察成骨细胞矿化水平。
　　 结果:
　　 (1)抗坏血酸和β-GP诱导小鼠成骨细胞矿化过程中，随着诱导时间延长，miR-93表达逐渐降低。
　　 (2)用PAJ-U6-CMV-eGFP vector成功构建miR-93慢病毒稳定表达载体pre-miR-93，能在细胞中高表达miR-93。
　　 (3) miR-93过表达能抑制成骨细胞矿化形成，降低矿化结节茜素红定量。
　　 结论:
　　 构建了miR-93表达载体，过表达miR-93可以抑制小鼠成骨细胞矿化。
　　 第三部分miR-93调控成骨细胞矿化的机制研究
　　 目的:
　　 预测并验证miR-93与其作用的靶基因间的相互作用，阐明miR-93/Sp7调控环路在小鼠成骨细胞矿化的作用机制。
　　 方法:
　　 用TargetScan和rna22等靶基因预测软件分析得到小鼠原miR-93的靶基因。将含有miR-93结合位点的靶基因Sp7(trans-actingtranscription factor7，Osterix) CDS片段克隆到pGL3载体，构建野生型报告载体WT-pGL3-Sp7-CDS。用QuickChange site-directedmutagenesis试剂盒构建了含有突变靶位点的突变型报告载体MUT-pGL3-Sp7-CDS。将这两个载体分别与pre-miR-93或对照(miR-C)共同转染小鼠成骨细胞，检测荧光素酶活性变化以证实该靶基因是否为miR-93作用的靶基因。小鼠成骨细胞单独转染pre-miR-93，Western印迹杂交和实时定量PCR分别检测靶基因Sp7蛋白和mRNA水平的变化，明确miR-93对靶基因Sp7的调控作用。PCR扩增Sp7的CDS区全长，连接到pAJ慢病毒表达载体构建野生型Sp7-CDS表达载体，同时用QuickChange site-directed mutagenesis试剂盒构建了含突变靶点的突变型Sp7-CDS表达载体。将这两个表达载体分别与pre-miR-93或miR-C共同转染小鼠颅骨成骨细胞，稳定转染后茜素红染色观察成骨细胞矿化小结的形成，靶基因蛋白表达用Western印迹杂交检测，进一步证实Sp7为miR-93在成骨细胞矿化过程中重要的靶基因。通过公布的小鼠转录起始位点(TSS)预测文库，根据第四位赖氨酸三甲基化的H3组蛋白(H3K4me3)在TSS位点周围的富集与启动子CpG岛为主要标识，预测miR-93的TSS。运用TF-seach转录因子结合位点预测软件分析miR-93的TSS上游2kb内的DNA序列，预测miR-93启动子区可能结合的转录因子。通过凝胶迁移滞后实验(EMSA)、染色质免疫沉淀法(ChIP)，验证Sp7与所预测结合位点的相互关系。采用转录因子荧光素酶报告基因活性进一步验证Sp7与miR-93的TSS上游2kb内的DNA序列的结合及对miR-93的转录抑制作用。通过PCR扩增Sp7 cDNA并亚克隆至pAJ载体，构建Sp7表达载体pAJ-Sp7，慢病毒稳定转染成骨细胞，并构建特异性阻断Sp7蛋白表达的慢病毒短发卡RNA(shRNA)-Sp7表达载体，转染成骨细胞，建立稳定转染，分别采用Northern blot和qRT-PCR检测miR-93的表达，研究Sp7对miR-93表达的调控作用。
　　 结果:
　　 (1) TargetScan和rna22等靶基因预测软件预测Sp7为miR-93作用的靶基因。
　　 (2)与转染miR-C对照组相比，pre-miR-93和WT-pGL3-Sp7-CDS共转染组的荧光素酶活性受到明显的抑制，而pre-miR-93和MUT-pGL3-Sp7-CDS共转染组的荧光素酶活性则无明显变化。
　　 (3)单独转染pre-miR-93可以降低Sp7蛋白水平，而对Sp7mRNA水平无影响。
　　 (4) pre-miR-93与WT-pAJ-Sp7共同转染能减少成骨细胞矿化，降低Sp7蛋白表达水平;而pre-miR-93与MUT-pAJ-Sp7共同转染不能降低成骨细胞矿化水平，对Sp7蛋白水平没有影响，突变型Sp7 CDS全长可以消除miR-93所致的对成骨细胞矿化的抑制作用及其对Sp7蛋白表达的抑制作用。
　　 (5) TF search转录因子预测软件预测Sp7在miR-93的TSS上游2kb内的DNA序列的结合。
　　 (6)凝胶迁移滞后实验(EMSA)示Sp7蛋白与靶结合位点的结合，特异性Sp7抗体验证了Sp7的存在，靶结合位点的突变则无蛋白质与结合结合位点的结合。
　　 (7) ChIP实验证实Sp7结合于所预测的转录因子结合位点。
　　 (8)与转染control对照组相比，Sp7和WT-pGL3-promoter共转染组的荧光素酶活性受到明显的抑制，而Sp7和MUT-pGL3-miR-93-promoter共转染组的荧光素酶活性则无明显变化。因此，我们认为miR-93主要通过抑制Sp7蛋白表达来抑制成骨细胞矿化，而Sp7可以通过抑制miR-93的转录来促进成骨细胞的矿化。
　　 (9)单独转染Sp7可以降低miR-93的表达水平，而单独转染sh-Sp7可以提高miR-93的表达水平。
　　 结论:
　　 (1)构建了野生型和突变型Sp7 CDS荧光素酶报告基因载体、miR-93表达载体、野生型和突变型miR-93启动子区靶结合序列荧光素酶报告基因载体以及野生型和突变型Sp7 CDS全长慢病毒表达载体。
　　 (2)通过靶基因预测软件预测并经荧光素酶报告基因检测证实Sp7为miR-93作用的靶基因，且通过靶基因预测软件预测并经凝胶迁移滞后实验、染色质免疫沉淀实验、启动子荧光素酶报告基因检测证实Sp7为miR-93的转录因子，且抑制其转录活性。
　　 (3) miR-93在转录后水平抑制Sp7表达，抑制成骨细胞矿化。Sp7作为miR-93的转录因子，抑制miR-93的转录，促进成骨细胞矿化。Sp7是miR-93和Sp7形成了相互制约的调控环路，并在成骨细胞矿化过程中起重要的调控作用。

目录

声明

摘要

英文缩写词

前言

第一部分 小鼠成骨细胞矿化过程中microRNA表达谱研究

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

结论

第二部分 miR-93对成骨细胞矿化的功能研究

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

结论

第三部分 miR-93调控成骨细胞矿化的机制研究

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

结论

总结

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表论文及获奖情况