雌激素对脑缺血再灌注损伤神经元的保护作用及机制探讨

摘要

目的:
　　 1.研究雌激素（17-β雌二醇，E2）对氧糖剥夺/复氧复糖(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)大鼠皮层神经元的影响并探讨其作用机制。
　　 2.研究E2对大鼠脑缺血再灌损伤的作用并初步观察其作用机制。
　　 方法:
　　 选择原代培养的Sprague-Dawley(SD)大鼠大脑皮层神经元，通过测定LDH漏出率和MTT比色法检测细胞活力作为评价指标，建立体外OGD/R损伤模型。在此基础上，通过LDH漏出率的测定、MTT比色法、流式细胞术、Hoechst33342染色观察E2对皮层神经元OGD/R损伤的影响，RT-PCR、Western blotting、荧光活性测定和Fura-2/AM荧光探针标记等方法探讨Ca2+/calpain/caspase12介导的凋亡途径在E2神经保护中的作用。雌性SD大鼠行卵巢切除术排除内源性E2的干预，通过大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌损伤模型，通过神经功能评分、TTC染色、脑梗塞体积计算评价模型稳定性，TUNEL染色，免疫组织化学染色和荧光定量法测定caspase12活性，观察E2对缺血再灌神经细胞凋亡的影响及caspase12活性的变化。
　　 结果:
　　 1、E2对大鼠皮层神经元OGD/R损伤的影响
　　 (1)用Western blotting的方法，在体外培养10d的大脑皮层神经元和生后10d大鼠的大脑皮层组织均检测到ER蛋白的表达。
　　 (2)不同浓度E2对OGD/R损伤神经元的影响
　　 ①E2预处理降低OGD/R损伤神经元LDH漏出率，增强细胞活力的效应均从1nM开始出现，且呈剂量依赖性，在100nM达最高峰，0.1nM的E2预处理对OGD/R损伤神经元无明显影响。
　　 ②在OGD前0h、6h、12h、24h4个时间点加入终浓度为10nM的E2，均使细胞活力增高，细胞凋亡率降低。OGD前24h加入E2的保护效应最强，OGD前0h、6h和12h三个时间点加入E2保护效应无统计学差异。
　　 (3)1μMER抑制剂ICI182，780可完全阻断E2的神经保护效应，提高E2预处理OGD/R损伤神经元的LDH漏出率和凋亡率，降低细胞活力。
　　 2、E2对OGD/R损伤皮层神经元的保护作用与Ca2+/calpain/caspase12凋亡通路的关系
　　 (1) Fura-2/AM荧光探针标记，双波长分光光度计检测结果显示，OGD/R损伤致神经元细胞内Ca2+浓度升高;E2预处理可显著降低OGD/R损伤神经元细胞内Ca2+浓度;ER阻断剂ICI182，780能阻断E2的作用，细胞内Ca2+浓度升高(与OGD/R损伤组无统计学差异，p＞0.05)。
　　 (2) RT-PCR结果显示:OGD/R损伤时，皮层神经元caspase12和GRP78 mRNA表达增加;E2预处理降低OGD/R损伤神经元 caspase12和GRP78 mRNA的表达。
　　 (3) Western blotting结果显示:与空白对照组相比，OGD/R损伤时145kD SBDP蛋白表达（反应calpain活性）增高，procaspase12蛋白表达减少;E2预处理后145kD SBDP蛋白表达降低，calpain活性下降，procaspase12蛋白表达升高。
　　 (4) caspase12活性测定结果显示:OGD/R损伤时caspase12活性升高，calpain抑制剂ALLN(5μ M)和E2可降低OGD/R损伤时皮层神经元caspase12活性。
　　 (5) Calpain抑制剂ALLN降低OGD/R损伤神经元LDH漏出率和凋亡率，提高细胞活力，保护OGD/R损伤神经元。
　　 3、E2对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用
　　 (1) E2对MCAO大鼠的影响:MCAO术后大鼠神经行为学评分升高，梗塞体积增加，E2预处理减轻大鼠神经行为学症状和脑梗塞体积。HE和Nissle染色显示:MCAO大鼠缺血侧脑组织细胞边界不清，排列紊乱，尼氏体减少甚至丢失;E2预处理可改善MCAO大鼠组织形态学变化，提高神经元存活数量。
　　 (2)假手术组大鼠偶见TUNEL染色阳性细胞，MCAO大鼠有大量阳性细胞，且主要分布于缺血周围区，E2显著降低缺血侧脑组织凋亡细胞数。
　　 (3)免疫组化和荧光活性测定结果显示:假手术组有大量procaspase12阳性细胞，且分布均匀;MCAO大鼠缺血周围脑组织procaspase12蛋白表达较少，而caspase12活性升高;E2预处理组procaspase12蛋白表达增多，caspase12活性降低。提示E2通过抑制procaspase12裂解降低caspase12活性。
　　 结论:
　　 1.E2对体外培养的大鼠大脑皮层神经元OGD/R损伤具有保护作用，并呈一定的量效和时效关系。E2的保护作用可被其受体阻断剂ICI182，780所阻断。
　　 2.ERS参与了OGD/R诱导的神经元损伤，E2可抑制OGD/R神经元的ERS。
　　 3.Ca2+/calpain/caspase12途径参与了OGD瓜损伤皮层神经元的凋亡，E2通过抑制此途径减轻OGD/R损伤神经元的凋亡。
　　 4.E2对大鼠脑缺血再灌损伤具有保护作用，其保护作用可能与E2降低caspase12活性，抑制细胞凋亡有关。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

第一章 E2对大鼠皮层神经元OGD／R损伤的影响

1．1 材料与方法

1．1．1 材料

1．1．2 方法

1．2 结果

1．2．1 神经元培养与鉴定

1．2．2 E2受体蛋白的表达

1．2．3 E2对OGD／R损伤神经元的影响

1．3 讨论

1．4 结论

第二章 E2对OGD／R损伤皮层神经元的保护作用与Ca2+／calpain／caspase 12凋亡通路的关系

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果

2．2．1 E2预处理对OGD／R损伤神经元细胞内Ca2+浓度的影响

2．2．2 E2对Caspase 12、caspase 7和GRP 78 mRNA水平的影响

2．2．3 E2对OGD／R损伤神经元calpain、caspase 12活性的影响

2．2．4 抑制calpain活性对OGD／R损伤皮层神经元的影响

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 雌二醇对大鼠脑缺血／再灌注损伤的保护作用

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果

3．2．1 大鼠神经功能评分

3．2．2 TTC染色和大鼠脑梗塞体积比

3．2．3 E2对MCAO大鼠神经元细胞形态的影响

3．2．4 E2对MCAO大鼠神经元凋亡的影响

3．2．5 蛋白含量测定

3．2．6 E2对MCAO大鼠procaspase 12蛋白表达和caspase 12活性的影响

3．3 讨论

3．4 结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间主要的研究成果