TAB182在电离辐射诱导HeLa细胞DNA损伤修复中的作用

摘要

目的
　　 研究TAB182参与电离辐射诱导DNA损伤修复的生物学功能，初步探讨TAB182参与DNA损伤修复的分子机制，进一步从分子水平上认识人类的健康和疾病发生的基础，为维持人类健康和疾病治疗药物特别是抗癌药物的研发提供分子水平的理论依据。
　　 实验方法
　　 通过shRNA技术构建TAB182基因沉默的细胞株，研究TAB182基因沉默的细胞株在电离辐射诱导DNA损伤的实验条件下，平板克隆形成实验研究TAB182基因沉默的细胞株的放射敏感性，流式细胞术分析电离辐射诱导的TAB182基因沉默细胞株的细胞周期阻滞，Western blot分析TAB182基因沉默的细胞中DNA损伤修复相关蛋白的水平。TDR双阻滞法对TAB182基因沉默的细胞进行细胞周期同步化，研究TAB182在细胞周期进程中的作用。HeLa细胞中瞬时转染PLPC-Myc-TAB182-FL载体，Western blot和激光共聚焦显微镜分析TAB182对DNA-PKcs磷酸化的影响，通过免疫共沉淀技术研究内源性的TAB182与DNA-PKcs的相互作用以及TNKS与DNA-PKcs的相互作用。
　　 结果
　　 1.TAB182受电离辐射诱导表达。HeLa细胞在经过4Gy照射处理后，TAB182在2h左右表达水平最高;HeLa细胞经过不同剂量的电离辐射处理，2h后HeLa细胞中TAB182的表达含量经过4Gy照射剂量处理组表达最高，说明TAB182主要受中低剂量的电离辐射诱导表达，且TAB182的表达存在一定剂量依赖性。
　　 2.TAB182、DNA-PKcs、TNKS的相互作用。免疫荧光原位杂交试验发现TAB182与2056位点磷酸化的DNA-PKcs存在共定位，免疫共沉淀证实TAB182与DNA-Pkcs存在相互作用，TNKS与DNA-Pkcs也存在相互作用。
　　 3.shRNA沉默TAB182表达导致HeLa细胞放射敏感性增加。通过shRNA技术建立了TAB182基因稳定沉默的细胞株，通过细胞克隆形成实验发现TAB182基因沉默的细胞株对4Gy内的中低剂量γ课题来源:国家自然科学基金项目，项目批准号:(No.30970677，No.81071678)射线照射的敏感性明显增加，但并不增加对8Gy大剂量照射的敏感性。
　　 4.TAB182参与细胞周期进程的调节。Tdr双阻滞法同步细胞周期发现TAB182在细胞不同的细胞周期进程中表达含量不同，同时同步化TAB182基因沉默的细胞的细胞周期发现，与对照细胞相比，TAB182基因沉默的细胞S期进程加快，说明TAB182参与细胞周期S期进程的调节。
　　 5.TAB182参与电离辐射诱导的细胞周期阻滞进程的调节。流式细胞术分析电离辐射诱导的细胞周期阻滞发现，TAB182基因沉默的细胞G2/M期阻滞时间明显比对照细胞长。
　　 6.TAB182对DNA损伤应激相关蛋白表达的调节。Western Blot分析发现在TAB182基因沉默的细胞中DNA损伤修复蛋白如DNA-Pkcs、ATM、Chk2、P53的水平与对照细胞相比明显要低。
　　 7.TAB182对DNA-PKcs磷酸化的影响。在HeLa细胞中瞬时转染PLPC-myc-TAB182-FL质粒，Western blot和免疫荧光显微镜实验分析表明TAB182能够增加DNA-PKcs自磷酸化位点S2056的磷酸化，Western blot分析TAB182基因沉默的细胞中DNA-Pkcs各磷酸化位点的磷酸化也得到一致的结果。
　　 结论
　　 1.TAB182参与DNA损伤修复通路，
　　 2.TAB182与DNA-PKcs存在相互作用，能够特异性的增加DNA-PKcs的自磷酸化位点S2056的磷酸化，
　　 3.TAB182参与有丝分裂S期进程的调节和电离辐射诱导G2/M期阻滞进程的调节。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 试剂与材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要抗体

2．1．3 主要仪器

2．2 细胞培养和照射条件

2．3 转化与质粒提取

2．3．1 转化

2．3．2 质粒提取

2．4 细胞转染

2．5 免疫荧光染色

2．6 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-IP)

2．7 细胞周期的同步化

2．8 细胞周期测定

2．9 细胞平板克隆形成实验

2．10 生长曲线的测定

2．11 蛋白定量

2．11．1 标准曲线绘制

2．11．2 待检测样本蛋白定量

2．12 Western blot测定相关蛋白表达水平

2．13 统计学分析

第三章 实验结果

3．1 TAB182受电离辐射诱导表达

3．2 TAB182/DNA-PKcs/TNKS的相互作用

3．3 shRNA沉默TAB182表达导致HeLa细胞放射敏感性增加

3．3．1 TAB182低表达细胞株的建立

3．3．2 HeLa-NC与HeLa-shTAB182生长曲线的测定

3．3．3 shRNA沉默TAB182表达导致HeLa细胞放射敏感性增加

3．4 TAB182参与细胞周期进程的调节

3．4．1 TAB182在HeLa细胞处在各细胞周期中的表达

3．4．2 HeLa细胞TAB182低表达导致细胞周期S期进程的加快

3．5 TAB182参与电离辐射诱导的细胞周期阻滞进程的调节

3．6 TAB182对DNA损伤反应蛋白表达的调节

3．7 TAB182对DNA-PKcs磷酸化的影响

第四章 讨论

4．1 TAB182与DNA损伤修复

4．2 TAB182与细胞周期

4．3 TAB182与DNA-PKcs

第五章 结论

参考文献

综述

致谢

研究生期间的成绩