中国HIV-1感染者外周血细胞病毒库在HAART中的变化及其与细胞因子的关系

摘要

高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy, HAART)的广泛应用使得人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus HIV)感染所致艾滋病(Acquied immunodeficiency symdrom，AIDS)的病死率及传染率明显下降。HAART治疗不仅可以有效抑制人类免疫缺陷病毒的复制，降低艾滋病患者血清中的病毒载量至现有检测方法测不出的水平，还能升高CD4+T细胞水平，重建HIV-AIDS患者的免疫功能。然而，单纯的HAART治疗无法彻底治愈HIV感染。一旦停止HAART，便会出现病毒反弹，这就使得IV-AIDS需要终身坚持HAART治疗，但是长期使用抗病毒药物会出现一些问题:例如药物毒副作用、依从性差、耐药以及沉重的经济负担。HIV感染者不能根治的关键是HIV病毒储存库的持续存在。
　　 HIV的病毒储存库包括某些细胞和组织器官。细胞储存库主要有CD4+淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞，还可能有NK细胞和CD8+T细胞等，有报告认为CD4/CD8双阳性T细胞以及CD4/CD8双阴性T细胞都可能潜伏HIVDNA。国外关于CD4+T淋巴细胞以及外周血单个核细胞(PBMC)作为HIV-1储存库的研究较多，但是对于外周血T淋巴细胞以及单核细胞内HIV-1前病毒DNA的长期追踪研究不多见，对NK细胞内是否存在潜伏感染的HIV前病毒DNA更是有争议。目前我国的同类研究报告少见。本研究对15例接受HAART治疗4-7年的AIDS患者进行外周血NK细胞、T淋巴细胞以及单核细胞内HIV-1前病毒DNA的检测，发现这些患者这三种细胞内仍有不同程度的HIV-1潜伏感染。本研究还通过前瞻性研究方法，观察40例接受24月HAART治疗的HIV/AIDS患者外周血NK细胞、T淋巴细胞以及单核细胞内HIV-1前病毒DNA的动态变化情况，分析其与CD4+T细胞计数、外周血HIV-1 RN水平、Th1(Helper T lymphocyte1，辅助T淋巴细胞1)细胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2细胞因子(IL-4、IL-10)以及L-15的关系，观察抗病毒治疗对三种外周血细胞内HIV病毒储存库的影响，以及淋巴因子在抗病毒免疫重建中可能扮演的角色;探索在血清HIV-1RNA低于检测下限时HIV-1前病毒NA作为判断抗病毒治疗疗效以及病情进展预测新指标的价值，并为日后进一步探索彻底清除HIV病毒的新治疗措施奠定基础。
　　 本研究包括以下两部分:
　　 第一部分中国HIV-AIDS外周血细胞病毒储存库在HAART中的动态变化
　　 目的:本研究拟了解NK细胞是否是HIV-1病毒的储存库细胞之一，并对中国HIV-1感染者两年HAART治疗过程中外周血NK细胞、T淋巴细胞以及单核细胞中HIV-1DNA水平的变化进行前瞻性的动态观察，对其与主要的免疫学指标（外周血CD4+T细胞计数）和病毒学指标(血浆HIV-1RNA)的关系进行分析，观察抗病毒治疗对三种血细胞内HIV病毒储存库的影响，并观察在血清HIV-1RNA低于检测下限时，HIV-1前病毒对于判断抗病毒治疗疗效以及预测病情进展的意义。
　　 方法:对15例接受HAART治疗4-7年的患者采集血标本进行横断面研究。对40例未接受HAART治疗的HIV/AIDS患者在启动HAART治疗后进行为期两年的随访观察，在HAART基线（0月）、启动治疗后6月、12月、18月及24月五个时间点采集患者的血标本。使用磁珠分选法从外周血单个核细胞(PBMC)中分离出T淋巴细胞、单核细胞和NK细胞，通过HIV实时荧光定量PCR检测外周血HIV-1 RNA病毒载量，NK细胞、单核细胞和T淋巴细胞内的HIV-1 DNA水平，流式细胞术检测外周CD4+T细胞数量，对数据进行统计学处理及相关性分析。
　　 结果:15名接受4-7年（平均62.45±13.53月）HAART治疗的HIV/AIDS患者外周血HIV-1RNA均低于检测下限(＜50拷贝/ml即＜1.69l0g拷贝/ml); T淋巴细胞中HIV-1前病毒DNA的平均含量2.03±0.48(log拷贝/106个细胞);NK细胞中HIV-1前病毒DNA均值为1.82±0.32(log拷贝/106个细胞);单核细胞中HIV-1前病毒DNA均值为1.75±0.19(log拷贝/106个细胞);3种细胞中HIV-1 DNA阳性者比例分别为6/15、4/15、2/15。40例随访患者在HAART治疗启动后0月，6月，12月，18月及24月的CD4+T细胞计数（X±SD）分别为194.98±95.25个/μl，325.68±99.38个/μl，387.36±133.94个/μl，433.38±136.72个/μl，483.58±133.86个/μl，血清中HIV-1RNA log值的平均水平(X±SD)分别为4.35±1.15，1.76±0.46，1.75±0.32，1.97+1.03，＜1.69(log拷贝/ml)。统计学分析显示:外周血HIV-1 RNA水平和CD4+T细胞计数呈负相关。在HAART治疗0月，6月，12月，18月及24月，NK细胞中HIV-1前病毒DNA平均log值为3.40±0.79，2.51±0.53，2.40±0.43，2.18±0.42，2.02±0.42(log拷贝/106个细胞);T淋巴细胞中HIV-1前病毒DNA平均log值为3.71±0.67，2.99±0.51，2.49±0.42，2.23±0.48，2.11±0.36(log拷贝/106个细胞);单核细胞中HIV-1前病毒DNA平均log值为2.92±0.78，2.04±0.29，2.03±0.22，2.01±0.27，1.97±0.1(log拷贝/106个细胞）。随着HAART治疗的进行，三种细胞中的平均HIV-1 DNA载量均呈下降趋势，与血清RNA载量的下降和CD4计数的上升趋势一致。且在治疗启动后的前12个月下降比较明显。统计学分析显示:在HAART治疗过程中，外周血T淋巴细胞与NK细胞中的HIV-1 DNA水平与外周血HIV RNA水平之间都呈正相关关系，与外周血CD4+T细胞计数均呈负相关关系;而单核细胞内HIV-1DNA虽然与外周血HIV RNA水平呈正相关关系但与CD4+T细胞的关系不明显。NK细胞中与T淋巴细胞中HIV-1 DNA水平在HAART治疗不同时期均呈显著正相关，NK细胞中与单核中HIV-1 DNA水平在HAART治疗不同时期呈正相关或无相关关系。
　　 结论:
　　 1、发现中国HIV-1感染者外周血中除了T淋巴细胞和单核细胞外，CD3-CD56+NK细胞也可能是HIV-1的病毒储存库之一。在长期HAART治疗(4-7年)后，尽管表现出明显的抗病毒效果和免疫重建效果,仍然不能彻底清除CD3-CD56+NK细胞、CD3+T淋巴细胞和CD14+单核细胞中的HIV-1前病毒DNA。
　　 2、前瞻性观察到在两年HAART治疗中，外周血HIV-1 RNA水平明显下降，CD4+T细胞数量明显上升，二者呈显著的负相关关系;随着外周血HIV-1 RNA水平降低，T淋巴细胞以及CD3-CD56+NK细胞中的HIV-1 DNA也逐步减少;二者呈显著的正相关关系;同时，外周血CD4+T细胞计数与这两种细胞中的HIV-1DNA的水平呈负相关关系，提示HIV-1前病毒DNA的检测对于抗病毒治疗疗效的判断以及病情进展的预测都有着重要的意义。
　　 3、随着HAART治疗的进行，外周血T淋巴细胞、单核细胞和NK细胞中HIV DNA水平均逐步减少，但是T淋巴细胞中的下降速度最慢，提示T淋巴细胞可能是HIV病毒最主要的细胞储存库。
　　 第二部分中国HIV-AIDS在HAART中外周血细胞病毒储存库与细胞因子的关系
　　 目的:本研究通过观察在两年HAART治疗过程中，外周血细胞HIV病毒储存库(NK细胞、T淋巴细胞及单核细胞内的HIV-1 DNA)与Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2细胞因子(IL-4、IL-10)以及IL-15的关系，以期进一步探索这些细胞因子在免疫治疗清除HIV-1病毒储存库中的作用。
　　 方法:对40例初次接受HAART治疗的HIV/AIDS进行为期两年的随访观察，在HAART基线、启动治疗后6月、12月、18月及24月五个时间点采集患者的血标本。使用磁珠分选法从外周血单个核细胞(PBMC)中分离出T淋巴细胞、单核细胞和NK细胞，通过HIV实时荧光定量PCR检测外周血HIV-1 RNA病毒载量、NK细胞、单核细胞和T淋巴细胞内的HIV-1 DNA水平，流式细胞术检测CD4+T细胞数量，ELISA法测定血浆Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2细胞因子(IL-4、IL-10)以及IL-15的浓度。同时对40例正常人血清中的Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2细胞因子(IL-4、IL-10)以及IL-15的浓度进行检测。并对数据进行统计学处理及相关性分析。
　　 结果:40例患者在HAART启动的0月、6月、12月、18月和24月各时间点，血浆中Th1细胞因子(IL-2和IFN-)浓度呈逐渐升高趋势，Th2细胞因子(IL-4和IL-10)浓度呈下降趋势，IL-15浓度呈升高趋势。IFN-γ、IL-4与IL-10在各个治疗时间点与外周血CD4+T细胞计数及血浆HIV-1 RNA均无明显相关性。IL-2及IL-15与外周血CD4+T细胞计数在各个治疗时间点均呈正相关关系(IL-2与外周血CD4+T细胞计数:0月r=0.36，P=0.02;6月r=0.36，P=0.02;12月r=0.48，P=0.001;18月r=0.60，P＜0.001;24月r=0.68，P=0.001; IL-15与外周血CD4+T细胞计数:P值均＜0.001，0月r=0.52;6月r=0.81;12月r=0.63;18月r=0.68;24月r=0.66）。IL-2及IL-15浓度与外周血HIV-1 RNA载量均呈负相关关系（0月时IL-2:r=0.33，P=0.04;IL-15:r=0.34，P=0.03;6月以后绝大多数病例外周血HIV-1 RNA载量低于检测下限，故无相关性检测）。IL-2与T淋巴细胞内的HIV-1 DNA有负相关关系（0月r=0.35，P=0.03;6月r=0.49，P=0.001;12月r=0.32，P=0.04;18月r=0.49，P=0.001，;24月r=0.41，P=0.01），与NK及单核细胞内的HIV-1 DNA无明显相关; IL-15与T淋巴细胞（6月r=-0.49，P=0.003;24月r=0.54，P＜0.001）及NK细胞（6月r=0.67，P＜0.001;12月r=0.57，P＜0.001;24月r=0.51，P＜0.001）内的HIV-1 DNA水平负相关，与单核细胞内的HIV-1 DNA无明显相关;而IFN-γ、IL-4和IL-10浓度与三种细胞内的HIV-1DNA水平均无明显相关性。
　　 将40例患者按照外周血T淋巴细胞内HIV-1 DNA载量的下降速度分组，具体为按其在HAART治疗24月HIV DNA载量是否低于检测下限分为A组（低于检测下限组）和B组（未低于检测下限组），并对两组患者进行t检验后发现，在HAART治疗基线，这两组患者的IL-2水平无差异，而经过HAART治疗后，在6月、12月、18月及24月，两组患者的IL-2水平差异有统计学意义;T淋巴细胞内HIV-1 DNA载量24月检测不到的患者IL-2水平普遍高于24月HIV-1 DNA持续存在的患者。而对IL-15的t检验发现，在HAART基线、6月、12月、18月及24月，T淋巴细胞内HIV-1 DNA载量24月检测不到的患者IL-15水平均高于24月HIV-1 DNA持续存在的患者。
　　 结论:
　　 1、HAART治疗开始后各时间点，Th1细胞因子IL-2、IFN-r浓度和IL-15浓度逐渐上升，Th2细胞因子IL-4、IL-10浓度逐渐下降。IL-2及IL-15水平与CD4+T淋巴细胞数量呈正相关关系，与外周血HIV-RNA水平呈负相关关系，提示IL-2及IL-15可能与CD4+T淋巴细胞的增殖以及免疫重建相关。
　　 2、外周血T淋巴细胞内的HIV-1 DNA载量与IL-2水平呈负相关，而且T淋巴细胞内的HIV-1 DNA载量下降得快的患者血浆中IL-2水平明显升高，提示IL-2可能参与清除潜伏感染的T淋巴细胞病毒储存库的免疫机制。
　　 3、IL-15与外周血T淋巴细胞及NK细胞内的HIV-1 DNA载量呈负相关，而且T淋巴细胞内的HIV-1 DNA载量下降得快的患者血浆中IL-15水平明显升高，提示IL-15可能参与清除潜伏感染的T淋巴细胞及NK细胞病毒储存库的免疫机制。

目录

声明

摘要

英文缩写词注解

第一部分 中国HIV-AIDS外周血细胞病毒储存库在HAART治疗中的动态变化

第一章 前言

第二章 研究对象和方法

2．1 研究对象

2．2 用药方案

2．3 材料

2．4 实验方法

第三章 结果

3．1 长期HAART治疗的患者外周血T淋巴细胞、单核细胞及NK细胞中检测HIV前病毒DNA

3．2 两年HAART治疗患者的各项检测结果

第四章 讨论

第五章 结论

第二部分 中国HIV-AIDS在HAART中外周血细胞病毒储存库与细胞因子的关系

第一章 前言

第二章 研究对象和方法

2．1 研究对象

2．2 用药方案

2．3 材料

2．4 实验方法

第三章 结果

3．1 研究对象的一般资料

3．2 两年HAART治疗中CD4、CD8细胞计数，血浆HIV-1 RNA以及细胞内HIV-1 DNA水平的变化

3．3 两年HAART治疗中血浆Th1／Th2细胞因子以及IL-15水平变化情况

3．4 Th1、Th2细胞因子以及IL-15与外周血CD4+T细胞计数关系

3．5 Th1、Th2细胞因子以及IL-15与HIV-1 RNA关系

3．6 Th1、Th2细胞因子以及IL-15与外周血细胞内HIV-1 DNA关系

3．7 IL-2及IL-15与T淋巴细胞内HIV-1 DNA载量水平的关系

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述

致谢

攻读博士学位期间发表的主要论文