脂肪细胞特异性核酸适配体的筛选、分子识别及应用初探

摘要

第一部分建立针对3T3-L1脂肪细胞的指数级富集的配体系统进化技术
　　目的：本研究建立3T3-L1脂肪细胞分化模型,采用细胞的指数级富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment,cell-SELEX)针对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞进行文库筛选,并获得能识别脂肪细胞表面膜结构的核酸适配体(Aptamer)。
　　方法：设计并合成随机序列DNA文库,分别用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)及生物素biotin标记引物。将3T3-L1前脂肪细胞通过鸡尾酒方法诱导脂肪细胞分化,选用分化成熟的3T3-L1细胞作为正筛选细胞,而未分化的前体3T3-L1及HepG2作为负细胞,将文库与正负细胞反复孵育进行筛选,与正细胞结合文库采用聚合酶链法扩增并用作下轮筛选及鉴定。使用流式细胞技术对文库的富集程度进行监测,鉴定。采用454测序方法对富集文库进行测序,合成相关序列并通过流式细胞术进行鉴定。
　　结果：使用传统的鸡尾酒方法成功建立了脂肪细胞分化模型,通过应用cell-SELEX对分化成熟的脂肪细胞展开筛选,经过19轮正负筛选成功富集到针对分化成熟3T3-L1脂肪细胞的ssDNA文库,经过测序分析发现了4条核酸适体与该脂肪细胞有结合,分别命名为Adipo-2,Adipo-4,Adipo-5及Adipo-8.
　　结论：通过CELL-SELEX技术针对脂肪细胞进行筛选,可以获得与靶细胞高亲和性的核酸适配体。
　　第二部分脂肪细胞相关棱酸适配体及其功能研究
　　目的：在第一部分实验的基础上对筛选出针对脂肪细胞表面的核酸适配体进行特异性分析、解离常数测定及不同条件对其结合性能的影响,以进一步了解所筛选的核酸适配体的结合特性。
　　方法：合成筛选的核酸适配体,与不同系统来源的细胞进行结合试验,采用流式细胞术对其结合性能进行鉴定;将核酸适体稀释成不同浓度后与分化成熟3T3-L1脂肪细胞进行孵育,使用流式细胞仪检测不同浓度核酸适体的结合能力,并计算各核酸适体的解离常数;采用流式细胞术检测了核酸适体在不同温度孵育,胰岛素刺激靶细胞及核酸适体不同截短方案对其结合性能影响。
　　结果：核酸适体Adipo1和Adipo8均能与脂肪细胞结合,而对其它系统来源的细胞几乎没有结合性能。解离常数测定提示Adipo8,Adipo-1能与脂肪细胞高亲和力、高特异性结合,所测Kd值分别为17.5±5.1 nM和97.5±13.5 nM。4℃和37℃孵育条件对所测核酸适体的结合没有影响。Adipo8与分化成熟脂肪的3T3-L1脂肪细胞的结合能被trpsin及。Protienase K消化液消化,而Adipo1则不受影响。经过500nM胰岛素处理对Adipo1和Adipo8与分化成熟的脂肪细胞的结合几乎没有影响。
　　结论：核酸适配体Adipo8对分化成熟的脂肪细胞显示出良好的结合性及高度特异性,Adipo8可能的靶标为脂肪细胞表面某种与胰岛素作用不相关的膜蛋白,但具体机制有待进一步研究。
　　第三部分脂肪细胞核酸适配体的特异性分子识别及应用初探
　　目的：前述细胞实验表明,核酸适体Adipo8在体外显示出针对3T3-L1脂肪细胞的结合特异性,本部分实验通过大鼠冰冻组织切片进一步证实其特异性,探讨使用该核酸适配体用于监测脂肪细胞分化程度,流式分选分化成熟脂肪细胞及体内应用。
　　方法：雄性SD大鼠颈椎脱位法处死后,取附睾脂肪组织,肝脏骨骼肌及胰腺组织制成石蜡切片或直接冰冻切片。冰冻切片时,取上述新鲜组织用OCT包埋置于-20℃低温恒温器迅速冷冻后,切成10μm薄片,贴片后用4℃预冷的丙酮室温下固定15 min,用PBS洗后采用H&E染色及疫光核酸适配体染色。染色切片置于荧光显微镜下观察,比较两种方法处理组织时核酸适体对其结合情况;通过流式细胞术检测核酸适配体及对照文库对不同分化阶段的脂肪细胞的结合程度,探讨两者相对荧光强度与分化时间的相关性,采用流式细胞仪对与核酸适配体结合部分的脂肪细胞进行分选;将核酸适配体用cy5标记后将其经尾静脉注射入SD大老鼠,生理盐水灌注后取不同组织进行荧光检测以确定核酸适体的靶向性。
　　结果：核酸适配体Adipo-8与S-D大鼠冰冻附睾脂肪组织切片孵育后显示出很强的荧光信号,而冰冻肝脏,骨骼肌,胰腺组织与核酸适配体孵育后无荧光信号。对照核酸适体文库与大鼠冰冻附睾脂肪组织孵育未观察到荧光信号。核酸适体Adipo-8与对照文库的相对荧光强度与脂肪细胞分化时间呈正相关。Adipo-8经尾静脉注射到活体大鼠体内后未能在外周组织中观察到特异荧光信号。
　　结论：核酸适配体Adipo8能特异性与冰冻切片处理的脂肪组织及原代分离的大鼠脂肪细胞结合。核酸适配体可用来监测3T3-L1脂肪细胞分化程度及分化成熟脂肪细胞的分离。Adipo8可以用来发现脂肪细胞膜上特异性生物标记物及为可能开发出脂肪组织特异性药物靶向治疗载体提供理论基础。