磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路在中耳胆脂瘤发病机制中的作用研究

摘要

第一部分P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA在中耳胆脂瘤上皮中的表达及其意义
　　 目的:探讨P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达及其意义。
　　 方法:采用免疫组织化学方法检测40例后天性中耳胆脂瘤组织和20例正常外耳道皮肤组织中P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白的表达水平，并分析它们之间的相关性。
　　 结果:40例中耳胆脂瘤上皮组织标本中P-EGFR蛋白阳性率为65.0％(26/40);P-Akt蛋白阳性率为72.5％(29/40);cyclinD1蛋白阳性率为62.5％(25/40);PCNA蛋白阳性率为80.0％(32/40)。对照组20例正常外耳道皮肤组织中P-EGFR蛋白阳性率为20.0％(4/20);P-Akt蛋白阳性率为35.0％(7/20);cyclinD1蛋白阳性率为10.0％(2/20);PCNA蛋白阳性率为45.0％(9/20)。经统计学分析:P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA四种蛋白在中耳胆脂瘤组和正常外耳道皮肤组中的表达差异均有显著的统计学意义(P＜0.05);中耳胆脂瘤组中P-EGFR与P-Akt的表达、P-Akt与cyclinD1的表达、cyclinD1与PCNA的表达均呈显著正相关(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达增高，且中耳胆脂瘤组中P-EGFR与P-Akt的表达、P-Akt与cyclinD1的表达、cyclinD1与PCNA的表达均呈显著正相关，提示中耳胆脂瘤上皮细胞中EGFR活化的同时伴随着其下游效应因子P-Akt、cyclinD1和PCNA的活化。
　　 2.EGFR/PI3K/Akt信号通路可能在中耳胆脂瘤上皮细胞过度增殖机制中起到重要作用，参与了中耳胆脂瘤的发病机制。
　　 第二部分人正常外耳道表皮角质化细胞原代培养及鉴定
　　 目的:建立人正常外耳道表皮角质化细胞(humanextemalearcanalkeratinocytes)原代培养体系，观察细胞形态学特征与生物学特性，并对原代培养的细胞进行鉴定，为后续实验研究打下基础。
　　 方法:取中耳手术耳甲腔成形时切取的外耳道口皮肤作组织块培养，经选择性消化分离出表皮层作表皮角质化细胞培养。观察细胞形态及生长特征，行细胞计数并描绘细胞生长曲线图，采用免疫荧光染色方法对原代培养的细胞进行鉴定。
　　 结果:原代细胞培养约5d后可以观察到由数个细胞组成的细胞集落，细胞集落逐渐向外生长。约15d之后，所获得的细胞融合形成片状单细胞层。可见细胞呈现出多角形，相互连接呈铺路石状。免疫荧光染色可见细胞角蛋白染色呈阳性，符合人表皮角质化细胞的形态学特征与生物学特征。原代培养的正常外耳道表皮角质化细胞接种后2d内细胞增殖比较缓慢，第3d起细胞增殖速度加快，约第7～8d时达到峰值，其后细胞数量缓慢下降。
　　 结论:本实验所建立的细胞系为人正常外耳道表皮角质化细胞，该细胞系的建立为后续进一步探讨中耳胆脂瘤的发病机制提供了良好的研究材料。
　　 第三部分EGF对外耳道表皮角质化细胞增殖和迁移的影响及其作用机制
　　 目的:探讨EGF对原代培养的外耳道表皮角质化细胞增殖、细胞周期及迁移能力的影响，并检测EGF干预后EGFR、P-EGFR、Akt、P-Akt、cyclinD1等相关蛋白的表达变化情况。
　　 方法:分别用EGF、AG1478(EGFR抑制剂)与Wortmannin(PI3K抑制剂)干预原代培养的外耳道表皮角质化细胞，MTT实验检测其对细胞生长的影响;流式细胞术检测其对外耳道表皮角质化细胞周期的影响;transwell细胞迁移实验检测其对外耳道表皮角质化细胞迁移能力的影响;Westernblotting方法检测外耳道表皮角质化细胞EGFR、P-EGFR、Akt、P-Akt、cyclinD1等相关蛋白表达的改变情况。
　　 结果:
　　 1.MTT实验:EGF可以显著地促进原代培养的外耳道表皮角质化细胞的增殖，EGF对外耳道表皮角质化细胞生长的促进作用随着其作用浓度的提高与作用时间的延长而增强;用AG1478和Wortmannin预处理细胞后，发现AG1478和Wortmannin可以明显地抑制EGF对外耳道表皮角质化细胞的促增殖作用。
　　 2.流式细胞术:EGF刺激外耳道表皮角质化细胞后可使细胞S期比例增加，G1期比例减少;而用AG1478和Wortmannin预处理细胞后再用EGF刺激细胞，发现细胞G1期比例增加，S期比例减少。
　　 3.Westernblotting:EGF刺激外耳道表皮角质化细胞后，P-EGFR表达快速上调，干预40min时P-EGFR表达量达最高值;P-Akt表达也快速上调，干预20min时P-Akt表达量达最高值;cyclinD1表达在干预24h后明显升高。用AG1478和Wortmannin预处理细胞后再用EGF刺激细胞，Westernblotting结果发现P-EGFR、P-Akt和cyclinD1表达减少。整个实验过程中EGFR和Akt的总量并无变化。
　　 4.transwell细胞迁移实验:EGF干预组迁移到下室的外耳道表皮角质化细胞平均数目明显高于对照组(P＜0.05);AG1478+EGF干预组与Wortmannin+EGF干预组迁移到下室的外耳道表皮角质化细胞平均数目明显少于EGF干预组(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.EGF可激活EGFR/PI3K/Akt信号通路，从而促进外耳道表皮角质化细胞增殖;而EGFR/PI3K/Akt信号通路抑制剂AG1478和Wortmannin则可以抑制该作用。
　　 2.EGF可激活EGFR/PI3K/Akt信号通路，从而增强外耳道表皮角质化细胞的迁移能力，而EGFR/PI3K/Akt信号通路抑制剂AG1478和Wortmannin则可以抑制该作用。
　　 3.EGFR/PI3K/Akt信号通路可能参与了中耳胆脂瘤发病机制，靶向阻断该通路有望抑制中耳胆脂瘤的发生与发展。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词

前言

第一部分 P-EGFR，P-Akt，cyclinD1和PCNA在中耳胆脂瘤上皮中的表达及其意义

1 材料和方法

1．1 组织标本和临床资料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 实验方法

2 结果

2．1 P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的表达

2．2 P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白在中耳胆脂瘤上皮中表达的相互关系

3 讨论

4 结论

第二部分 人正常外耳道表皮角质化细胞原代培养及鉴定

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 倒置显微镜下观察外耳道皮肤角质化细胞的生长特征

2．2 细胞计数与生长曲线绘制

2．3 细胞鉴定

3 讨论

4 结论

第三部分 EGF对外耳道表皮角质化细胞增殖和迁移的影响及其作用机制

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 MTT法检测EGF、AG1478和Wortmannin对外耳道皮肤角质化细胞增殖的影响

2．2 流式细胞术检测细胞周期

2．3 Western blotting检测EGF、AG1478与Wortmannin对外耳道皮肤角质化细胞蛋白表达的影响

2．4 Transwell细胞迁移实验

3 讨论

4 结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间的论文发表情况及学生会议参与情况