Cr(Ⅵ)污染土壤的微生物多样性分析与Cr(Ⅵ)还原菌的筛选研究

摘要

本论文采用DGGE和RFLP技术分析了湖南某铁合金厂铬渣堆埋场附近的土壤样品的细菌多样性，并对土壤样品中的Cr(Ⅵ)还原菌进行了分离培养和生理生化特性研究。
　　 DGGE结果和RFLP结果均显示样品1中的细菌多样性最高，样品4次之，样品8最低。但三个样品中都含有Rhodobaca bogoriensis、Limnobacter thiooxidans、Halomonas sp.、Azoarcus sp.、Dethiobacteralkaliphilus和Hydrogenophaga sp.等6种菌。
　　 主成分分析(PCA)发现，化学元素组成影响铬污染土壤细菌多样性，样品8与另外两个样品的细菌多样性差异较大。典型对应分析(CCA)发现，三个样品中Thiomicrospira sp.、Marinobacteralkaliphilus、Brevundimonas sp.、Sphingomonas hunanensis、Azoarcussp.、Hydrogenophaga sp.、Indibacter alkaliphilus和Oxalobacteraceaebacterium等菌种与铬相关性大。
　　 采用富集培养和铺平板的技术从土壤样品中筛选到8株具有Cr(Ⅵ)还原能力的菌株，研究了pH值、温度、Cr(Ⅵ)浓度及金属离子对5株Cr(Ⅵ)还原菌还原Cr(Ⅵ)的影响，发现Exiguobacterium sp.Y2、Exiguobacterium sp.Y7、Pseudochrobactrum saccharolyticum strain W1和Pseudomonas aeruginosa strain W5还原Cr(Ⅵ)的最适pH值与其生长最适pH值一致; Bacillus sp.Y6、Exiguobacterium sp.Y7、Pseudochrobactrum saccharolyticum strain W1和Pseudomonasaeruginosa strain W5还原Cr(Ⅵ)的最适温度与最适生长温度一致，都为35℃。研究发现，Cr(Ⅵ)浓度越高，细菌的生长越受抑制。除了Exiguobacterium sp.Y2，Cr(Ⅵ)浓度越高，还原率越低。Co2+、Cu2+、Mn2、Ni2+和Zn2+对Pseudochrobactrum saccharolyticum strain W1还原Cr(Ⅵ)都有抑制作用;Co2+、Cu2+和Mn2+对Pseudomonas aeruginosastrain W5还原Cr(Ⅵ)有增强的作用;Co2+对Exiguobacterium sp.Y2还原Cr(Ⅵ)有增强作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 铬污染的来源及危害

1．1．1 铬污染的来源

1．1．2 铬污染的危害

1．2 微生物还原Cr(Ⅵ)的研究进展

1．2．1 可还原Cr(Ⅵ)的微生物

1．2．2 微生物还原Cr(Ⅵ)的机理

1．3 污染土壤微生物群落结构多样性的测定方法

1．3．1 传统微生物平板培养方法

1．3．2 基于PCR的分子生物学技术

1．4 本论文的研究背景和意义

1．5 本论文的主要研究内容

第二章 实验材料和研究方法

2．1 实验材料

2．1．1 培养基成分

2．1．2 土壤样品

2．2 Cr(Ⅵ)还原菌的筛选

2．3 研究方法—RFLP技术操作

2．3．1 基因组DNA的提取及纯化

2．3．2 细菌16S rDNA的PCR扩增

2．3．3 连接，转化和SP6，T7-PCR扩增

2．3．4 SP6，T7-PCR产物双酶切及电泳

2．3．5 送样测序及分析

2．4 研究方法—DGGE技术操作

2．4．1 样品DNA的提取及纯化

2．4．2 DGGE-PCR的扩增

2．4．3 DGGE试剂的准备

2．4．4 DGGE胶的制备

2．4．5 DGGE电泳

2．4．6 DGGE胶的染色(硝酸银染色法)

2．5 分析方法

2．5．1 土壤样品分析

2．5．2 Cr(Ⅵ)浓度测定

2．5．3 显微计数和pH值测定

2．5．4 饱和度分析及系统发育树的构建

2．5．5 统计分析

第三章 铬污染土壤的微生物多样性分析

3．1 土壤样品中细菌生物多样性的PCR-DGGE分析

3．1．1 PCR结果

3．1．2 DGGE电泳结果

3．2 土壤样品元素分析结果

3．3 土壤样品中细菌生物多样性的RFLP分析

3．3．1 土壤样品16S rDNA酶切结果及分析

3．3．2 细菌16S rDNA序列比对分析

3．3．3 系统发育树分析

3．3．4 主成分分析(PCA)与典范对应分析(CCA)

3．4 本章小结

第四章 铬还原菌株的筛选与特性研究

4．1 Cr(Ⅵ)还原细菌的筛选及鉴定

4．1．1 选择性培养基平板分离Cr(Ⅵ)还原细菌

4．1．2 测序及系统发育树的构建

4．2 菌株的生理生化特性研究

4．2．1 所筛选到菌株的Cr(Ⅵ)还原能力的比较

4．2．2 初始pH值对细菌还原Cr(Ⅵ)的影响

4．2．3 温度对细菌还原Cr(Ⅵ)的影响

4．2．4 初始Cr(Ⅵ)浓度对细菌还原Cr(Ⅵ)的影响

4．2．5 重金属离子对细菌还原Cr(Ⅵ)的影响

4．3 本章小结

第五章 结论

参考文献

致谢

硕士期间研究成果