血AMH与PCOS妇女辅助生殖技术结局的关系以及AMH mRNA在不同卵巢储备妇女颗粒细胞中的差异表达

摘要

随着首例试管婴儿的诞生,近20多年来,辅助生殖技术(assistedreproductive technology,ART)不断进步,成功率显著提高,但是卵巢储备功能仍然是影响体外受精。胚胎移植(in vitro fertilization andembryo transfer,IVF-ET)成功率的主要因素。临床中有多种方法用于评估卵巢的储备功能,常用的包括年龄、基础FSH、雌二醇、窦卵泡数目和早卵泡期抑制素B。但近年来大量的研究发现抗苗勒激素(anti-Mullerian hormone,AMH)较传统的指标能更准确的评估卵巢的储备功能和预测卵巢对促性腺激素的反应性,甚至发现卵泡合成AMH的能力与卵子和胚胎的质量相关,认为AMH可以预测ART妊娠结局,因此成为辅助生殖技术研究的热点。AMH引起关注的另一原因是研究发现其与多囊卵巢综合症(polycystic ovary syndrome,PCOS)卵泡发育异常相关。AMH在PCOS窦前卵泡中表达改变使卵泡募集增多,生长卵泡数目增加。同时PCOS妇女明显增高的血AMH可能降低卵泡对FSH的敏感性,抑制优势卵泡的选择,导致PCOS卵泡发育停滞。而且发现增高的血AMH反应了PCOS的严重程度。PCOS妇女是ART治疗中最常见的人群之一,但关于PCOS增高的AMH与其ART中卵巢反应性以及妊娠结局的研究很少。因此本研究分析PCOS妇女显著增高的AMH在ART中的预测意义。
　　此外,目前已经明确血AMH不仅反映了窦卵泡数目,而且与窦卵泡合成AMH的能力相关。确实,以多个小窦卵泡增多为特征的PCOS妇女血AMH水平的增高部分是由于单个卵泡合成AMH的能力增加。对卵巢储备功能低下的妇女,血AMH水平的降低通常认为是由于窦卵泡数目的减少,但其颗粒细胞生成AMH的能力是否下降还不清楚。目前关于不同卵巢储备状态的妇女其颗粒细胞合成AMH是否有差异的研究还未见报道,因此我们通过real-time PCR分析不同卵巢储备的妇女颗粒细胞AMH及其受体AMHRII mRNA的表达,通过ELISA检测卵泡液中AMH的水平,以了解不同卵巢储备的颗粒细胞AMH的合成是否有差异。
　　第一章月经周期第3天血抗苗勒管激素与多囊卵巢综合症妇女IVF结局的关系
　　[目的]研究月经周期第3天血抗苗勒激素(AMH)是否可以预测多囊卵巢综合症(PCOS)妇女在IVF中对控制性超排卵的反应性以及妊娠结局。
　　[方法]首次接受IVF治疗的164例PCOS妇女纳入本研究中。测定降调节前月经第3天促黄体生成素(LH)、睾酮(T)、雌二醇(E2)和胰岛素水平以及降调节后,超排前周期第3天血AMH水平。按照血AMH浓度的＜25％,25 to75％和＞75％将研究对象分为低、中和高AMH三组,比较三组病人对超排的反应性以及IVF的妊娠结局。
　　[结果]随着血AMH水平的升高,HCG日E2水平和获卵数显著增加,同时所需的促性腺激素剂量显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05)。低、中、高三组的受精率和优胚数目没有差异(P＞0.05)。高AMH组的胚胎种植率显著低于低和中AMH组(27 VS48.8和50％,P＜0.01)。与低和中AMH组相比,高AMH组的临床妊娠率也下降,(45.9 VS65和66.7％,P=0.09),但差异没有统计学意义。最后,通过二元回归分析发现血LH是唯一独立的可以预测胚胎种植率的指标(P=0.017)。
　　[结论]在PCOS妇女中,月经周期第3天的血AMH水平与IVF周期中卵巢对促性腺激素的反应呈正相关,但是伴有高AMH的妇女胚胎种植率下降,这可能与显著增高的LH相关。
　　第二章抗苗勒管激素在多囊卵巢综合症妇女克罗米芬+尿促性腺激素诱排中的预测意义
　　[目的]1.分析血抗苗勒管激素(AMH)是否可以预测多囊卵巢综合症(PCOS)妇女对克罗米芬(CC)+尿促性腺激素(HMG)诱排的反应性。2.观察血AMH在PCOS患者CC+HMG诱排中的变化。
　　[方法]52例采用CC+HMG诱排的PCOS患者纳入本研究中。根据是否有优势卵泡发育分为有反应组和无反应组,比较两组基础血AMH水平是否有差异。诱排后月经第2l天仍没有直径大于10mm的优势卵泡则定义为无反应。此外,测定月经第3天和21天(无反应组)或者HCG注射日(有反应组)血AMH,FSH,E2和LH水平,同时B超下计2-5mm窦卵泡个数。
　　[结果]1.CC+HMG诱排后无反应组基础血AMH浓度明显高于反应组(12.09±5.06 VS8.19±2.91,P＜0.01)。将基础血AMH9.44ng/ml作为衡量对CC+HMG治疗有无反应的界值,敏感度为66.7％,特异度为74.4％。2.对诱排有反应的PCOS妇女,从D3到HCG日,AMH水平从8.19±2.91ng/ml降至3.25±1.36ng/ml;无反应的PCOS妇女,从D3到21天,AMH水平从12.09±5.06ng/ml降至7.52±1.23ng/ml。两组AMH下降均与2-5mm窦卵泡数目减少和FSH的增高呈正相关。有反应组AMH下降与E2增高呈正相关,但无反应组中,二者没有关联。
　　[结论]血AMH水平可以作为一项预测PCOS妇女对诱排反应性的指标。诱排中,血AMH显著下降.可能与小窦卵泡数目减少和血FSH水平增高相关。
　　第三章闭经与月经稀发多囊卵巢综合症妇女内分泌代谢差异与促排卵反应的比较
　　[目的]比较月经稀发和闭经的PCOS患者内分泌和代谢特征以及对诱排反应性的差异。
　　[方法]对伴月经稀发或者闭经的154例PCOS不孕患者做回顾性分析,比较月经稀发与闭经组的内分泌和糖脂代谢参数以及药物诱排的结局。
　　[结果]闭经的妇女窦卵泡数目、T、LH、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显高于月经稀发组;两组的年龄、体重指数、FSH、血糖、胰岛素以及血脂水平没有显著差异。在CC联合HMG诱排时,闭经组的排卵率为84.62％(66/78),明显低于月经稀发组96.8％(121/125),但诱排天数和HMG用量明显高于月经稀发组。两组的优势卵泡数目、HCG日雌激素水平、内膜厚度和妊娠率没有统计学差异。
　　[结论]月经周期紊乱的程度可作为一项简洁、有效的预测PCOS内分泌和代谢异常以及对诱排反应性的临床指标。
　　第四章 AMH mRNA在不同卵巢储备妇女颗粒细胞中的差异表达
　　[目的]比较多囊卵巢(PCO)、正常卵巢储备(NOR)和卵巢储备低下(DOR)妇女颗粒细胞AMH的合成是否有差异。
　　[方法]收集30例PCO、20例NOR和17例DOR妇女在IVF治疗中获卵日的颗粒细胞。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)比较三组患者颗粒细胞AMH和AMHRII mRNA的表达,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定三组患者卵泡液中AMH水平。其中PCO组包括无排卵和排卵的患者各16和14例,进一步比较无排卵PCO、排卵PCO和NOR组AMH mRNA以及蛋白的表达。
　　[结果]三组患者的颗粒细胞中均见AMH和AMHRII mRNA阳性表达。AMH mRNA在PCO、NOR和DOR组颗粒细胞中的相对表达量为0.82±0.44,0.57±0.25和0.26±0.13,三组间的差异有显著统计学意义(P＜0.001)。通过两两比较,PCO组的表达量明显高于NOR组(P＜0.01);NOR组高于DOR组,差异有统计学意义(P＜0.05)。无排卵PCO颗粒细胞AMH mRNA相对表达量1.01±0.52,显著高于排卵PCO组0.62±0.19(P＜0.05)和NOR组0.57±0.25(P＜0.01)。排卵PCO组AMH mRNA的表达高于NOR组,但没有统计学意义(P＞0.05)。AMH在卵泡液中的水平与qRT-PCR结果趋势相一致。AMHRII mRNA在各组间的表达没有差异。
　　[结论]不同卵巢储备的颗粒细胞合成AMH的能力有差异。与正常储备者相比,卵巢储备低下的妇女颗粒细胞AMH mRNA的表达明显下降,卵泡液中AMH水平降低,提示低储备妇女颗粒细胞合成AMH的能力降低;无排卵PCO妇女AMH mRNA表达显著高于正常卵巢和排卵PCO,可能与其优势卵泡发育障碍相关。