载脂蛋白A5对脂肪细胞甘油三酯代谢的影响及其机制探讨

摘要

背景：
　　 肥胖严重影响人类健康，它不仅是代谢综合征表现要素，而且是糖尿病、心血管疾病及脂肪肝等多种疾病发生的独立危险因素。肥胖是由于能量摄入与能量消耗不平衡导致脂肪细胞储存过多甘油三酯(TG)、细胞体积异常增大的结果。大量研究证实，载脂蛋白A5(apoA5)与肥胖及其相关性疾病的发生密切相关，但其作用机制尚不明确。最新研究表明，apoA5可滞留在肝细胞内，定位于脂滴表面，并对肝细胞内TG含量起重要的调节作用，提示apoA5除了具有降低血浆TG的作用外，也参与调节细胞内TG的代谢。由于脂肪细胞是体内最大的TG储存池，同时也是肥胖治疗的重要靶点，我们推测:apoA5可能通过调节脂肪细胞内TG的代谢，从而影响肥胖的发生与发展。与上述假说一致的是，已有研究发现apoA5或含apoA5的脂蛋白能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)以及嵌合型Ⅰ受体SorLA特异性结合，后两者均属于低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员。更重要的是，转染了SorLA的细胞可通过受体介导的胞吞作用摄取含apoA5的脂蛋白。人脂肪细胞表面同样表达LDLR家族中的LRP1和极低密度脂蛋白受体。由此推测:脂肪细胞可能通过LDLR家族成员摄取apoA5，后者进入脂肪细胞后，通过影响TG代谢，调节脂肪细胞内的脂质蓄积。
　　 目的：
　　 观察apoA5是否可被人脂肪细胞摄取，apoA5被摄取后的亚细胞定位，以及apoA5是否可影响脂肪细胞TG的代谢及其可能的机制。
　　 方法：
　　 取行腹部外科手术患者的少量皮下脂肪组织，分离培养人脂肪间充质干细胞，并诱导分化为成熟的脂肪细胞。将重组人apoA5干预脂肪细胞，分别进行以下实验:(1)通过脉冲追踪实验和WesternBlot检测观察apoA5是否可被脂肪细胞摄取;(2)利用肝素和RAP干扰apoA5与LDLR家族成员的结合，验证LDLR家族成员是否参与了脂肪细胞摄取apoA5的过程;(3)用AlexaFluor488标记apoA5，通过油红O染色、免疫荧光检测和激光共聚焦显微镜观察，明确apoA5在脂肪细胞内的定位;(4)通过检测细胞内TG水平，观察apoA5对脂肪细胞内TG含量的影响;(5)通过油红O和DAPI染色，观察脂肪细胞脂滴形态学的变化;(6)观察apoA5对脂滴相关蛋白Cidec和perilipin基因及蛋白表达水平的影响;(7)观察apoA5对脂肪细胞脂解活性的影响;(8)观察apoA5对与TG代谢相关的基因以及棕色脂肪组织特异基因的表达水平的影响。
　　 结果：
　　 1、脉冲追踪实验证实:125(I)-apoA5可被人脂肪细胞摄取，且在追踪观察24小时后，仍有70％的125(I)-apoA5滞留在细胞内，另有30％的125(I)-apoA5发生了降解。此外，将apoA5干预后的脂肪细胞进行WesternBlot检测，同样证实apoA5可被脂肪细胞摄取。
　　 2、预先用肝素或RAP孵育脂肪细胞可使进入细胞内的125(I)-apoA5含量分别降低了61％和52％(P＜0.001)。同样，WesternBlot检测发现，预先用肝素或RAP干预均可使脂肪细胞摄取apoA5的含量显著减少。
　　 3、激光共聚焦显微镜观察发现，apoA5呈环状分布于脂滴周围，且与已知的脂滴相关蛋白perilipin共定位于脂滴表面。
　　 4、ApoA5呈浓度依赖性的降低了脂肪细胞内TG的含量，在作用48小时后最大降低幅度达到29％(P＜0.01)。
　　 5、ApoA5干预后脂肪细胞内脂滴的形态特征无显著变化。
　　 6、ApoA5显著下调了脂肪细胞脂滴相关蛋白perilipin和Cidec的mRNA及蛋白表达水平。
　　 7、ApoA5干预后，脂肪细胞的基础脂解活性和刺激状态下的脂解活性均显著增强，并伴有棕色脂肪组织特异表达的基因解偶联蛋白1及叉头框C2mRNA水平的显著上调。相反，与TG合成、水解，线粒体的生物合成及脂肪酸氧化等功能相关的基因表达水平无显著变化。
　　 结论：
　　 1、ApoA5可被人脂肪细胞摄取，且定位于脂滴表面，同时显著降低了脂肪细胞内TG的含量。LDLR家族成员参与了脂肪细胞摄取apoA5的过程。
　　 2、ApoA5可能通过下调脂滴相关蛋白perilipin和Cidec的表达，增加脂解活性和能量消耗，从而减少TG在脂肪细胞内的蓄积。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 载脂蛋白A5可被人脂肪细胞摄取

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

第二章 载脂蛋白A5定位于脂肪细胞脂滴表面并调节细胞内甘油三酯代谢

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

第三章 载脂蛋白A5影响脂肪细胞甘油三酯代谢的机制探讨

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间主要的研究成果