重组人乙酰胆碱受体亚单位诱导眼肌型重症肌无力的实验研究

摘要

第一章重组H-AChRγ亚单位免疫诱导眼肌型重症肌无力模型的建立
　　 目的:观察E.coli质粒表达重组人乙酰胆碱(human acetylcholinereceptor，H-AChR)γ亚单位免疫诱导HLA-DQ8转基因小鼠眼肌型实验性自身免疫性重症肌无力(ocular experimental autoimmunemyasthenia gravis，oEAMG)模型的建立并探讨oEAMG模型的特点，明确乙酰胆碱受体抗体（acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab）在oEAMG发病机制中的作用和特点。
　　 方法:HLA-DQ8转基因小鼠27只，随机平均分成H-AChRγ亚单位免疫组，E.Coli.提取物免疫组，CFA免疫组，用乳化于CFA的重组H-AChRγ亚单位，或E.Coli提取物，或纯CFA分别于0，30，60天免疫。第二次免疫后，每周进行一次小鼠眼部和全身症状评估，小鼠肌肉握力测量，实验结束前进行小鼠前庭眼反射检测。第二次免疫后第15天和45天收集小鼠血清，RIA检测小鼠血清AChR-Ab水平，ELISA检测小鼠血清中IgG、 IgG1、IgG2b、IgG2c、 IgM水平。
　　 结果:H-AChRγ亚单位免疫组9只小鼠中8只(89％)出现眼部症状，6只小鼠有完全上睑下垂症状，9只小鼠中6只(67％)小鼠出现轻度的全身症状（1级），而E.coli免疫组，CFA免疫组无明显眼部表现及全身肌力减退症状，H-AChRγ亚单位免疫组眼部及全身临床症状严重度评分明显高于其它两组（P均＜0.001）;第二次免疫后35天起，H-AChRγ亚单位免疫组小鼠肌肉握力与E.coli免疫组，CFA免疫组两组比较具有显著性差异(P均＜0.05），H-AChRγ亚单位免疫组小鼠肌肉握力在实验终止前降至最低;与E.coli免疫组，CFA免疫组两组相比，H-AChRγ亚单位免疫组小鼠水平维度的视动反应增益明显下降(P均＜0.05）;第二次免疫后15，45天，H-AChRγ亚单位免疫组小鼠血清中AChR-Ab和抗—AChR Ig(IgM、IgG、Ig2b、Ig2c、IgG1)水平均明显高于E.coli免疫组，CFA免疫组，差别有显著性（P均＜0.001）。
　　 结论:重组H-AChRγ亚单位能成功诱导小鼠oEAMG模型，AChR-Ab在诱导oEAMG发生和发展的过程中发挥重要作用。
　　 第二章重组H-AChRγ亚单位免疫诱导眼肌型重症肌无力模型免疫学发病机制研究
　　 目的:探讨重组H-AChRγ亚单位免疫诱导下oEAMG的免疫学发病机制。
　　 方法:HLA-DQ8转基因小鼠用乳化于CFA的重组H-AChRγ亚单位，或E.Coli提取物，或纯CFA分别免疫，免疫后第8天后，取淋巴结和脾淋巴细胞体外培养，3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖反应，收集培养上清液用ELISA检测IL-2，IFN-γ，IL-6，IL-10水平。第3次免疫后30天，流式细胞仪观察各组小鼠脾脏和淋巴结中CD4+CD25+细胞和CD19+细胞百分比变化，免疫荧光法检测3组小鼠眼外肌(extraocular muscle， EOM)和后肢肢体肌(limb muscle，LM)神经肌肉结点处(neuromuscularj unction，NMJ) IgG或补体沉积情况，RT-PCR法检H-AChRγ亚单位免疫组和CFA免疫组小鼠EOM和LM的AChRα，γ和ε亚单位mRNA转录水平的变化。
　　 结果:H-AChRγ亚单位免疫组小鼠淋巴结和脾淋巴细胞增殖反应显著高于E.Coli提取物或CFA免疫组（P均＜0.05），ELISA显示H-AChRγ亚单位免疫组小鼠淋巴细胞体外培养上清液中IL-2，INF-γ水平显著均高于E.coli提取物和CFA免疫组(P＜0.05），IL-6，IL-10水平与E.coli提取物和CFA免疫组相比均无显著差异(P均＞0.05）。流式细胞结果显示，H-AChRγ亚单位免疫组小鼠淋巴结和脾脏中CD4+CD25+细胞和CD19+细胞百分比显著高于E.coli提取物和CFA免疫组(P均＜0.05）。H-AChRγ亚单位免疫组小鼠EOM和LM NMJs处可见大量IgG，C3，和MAC沉积，而E.coli提取物和CFA免疫组小鼠NMJs未见IgG，C3，和MAC沉积(P均＜0.001）。与CFA免疫组相比，H-AChRγ亚单位免疫组小鼠EOM和LM的AChRα，γ和ε亚单位mRNA转录水平显著增高，有统计学差异（P均＜0.05）。
　　 结论:H-AChRγ亚单位免疫能诱导oEAMG和gEAMG的发生与发展，细胞免疫、体液免疫和补体等多种机制参与其发病。
　　 第三章重组H-AChRε亚单位免疫原性诱导眼肌型重症肌无力发病可能性研究
　　 目的:观察H-AChRε亚单位免疫原性在眼肌型重症肌无力发病机理中的作用，进一步探讨AChR亚单位诱导产生的自身免疫反应与oMG和oEAMG的关系。
　　 方法:通过PT-PCR检测HLA-DQ8转基因小鼠出生后0，1，2，4周EOM和LM的AChRα，γ和ε亚单位表达水平变化。HLA-DQ8转基因小鼠用乳化于CFA的重组H-AChRε亚单位，或E.Coli提取物，或纯CFA分别于0，30，60天免疫，第二次免疫后每周进行一次小鼠眼部和全身症状评估，小鼠肌肉握力测量，第二次免疫后第45天收集小鼠血清，RIA检测小鼠血清中AChR-Ab水平，ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2b、IgG2c、IgM水平，第3次免疫后30天，免疫荧光法检测小鼠NMJ处IgG或补体沉积情况。
　　 结果:EOM的AChRα，γ和ε亚单位的mRNA转录水平随出生后时间的增加无明显改变（P均＞0.05），在出生后第0周小鼠LM的中可见AChRγ亚单位的表达，无AChRε亚单位的表达，出生后第1周LM中，AChRγ亚单位的表达消失，出现AChRε亚单位的表达，而α亚单位表达无明显变化（P均＞0.05）。H-AChRε亚单位免疫组9只小鼠中3只(33％)有眼部症状，2只(22％)小鼠有轻度的全身症状（1级），而E.coli免疫组，CFA免疫组无明显眼部和全身改变，H-AChRε亚单位免疫组眼部和全身临床症状严重度评分明显高于其它两组(P均＜0.05）。H-AChRε亚单位免疫组小鼠平均肌力与E.coli免疫组，CFA免疫组两组比较无显著性差异（P均＞0.05）。第二次免疫后45天，H-AChRε亚单位免疫组小鼠血清中AChR-Ab和抗—AChR Ig(IgM、IgG、Ig2b、Ig2c、IgG1)水平均明显高于E.coli免疫组、CFA免疫组（P均＜0.01）。有明显眼部和全身症状的H-AChRε亚单位免疫组小鼠EOM和LM NMJs处可见大量IgG，C3，和MAC沉积，而E.coli提取物和CFA免疫组小鼠NMJs基本没有IgG，C3，和MAC沉积(P均＜0.01）。
　　 结论:HLA-DQ8转基因小鼠对H-AChRε亚单位免疫诱导的oEAMG的易感性低，可能与AChRε亚单位与HLA-DQ8分子的交互作用所诱导的自身免疫应答反应较弱有关。

目录

声明

摘要

本文英汉缩略语名词对照表

前言

第一章 H-AChRγ亚单位免疫诱导眼肌型重症肌无力模型的建立

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二章 HLA-DQ8转基因小鼠眼肌型重症肌无力模型免疫学发病机制研究

2．1 材料

2．2 方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 重组H-AChRε亚单位免疫诱导小鼠眼肌型重症肌无力模型的建立

3．1 实验材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

总结

参考文献

综述

致谢

学术成果