3%氯化钠促进U251细胞膜AQP4蛋白内化的研究

摘要

背景：水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一组与水的跨膜转运有关的膜蛋白家族，其中水通道蛋白4（Aquaporin-4，AQP4）在脑组织中广泛分布，已有研究表明AQP4是星形胶质细胞水肿形成的限速环节。本课题组前期的研究已发现用3％氯化钠处理15min，星形胶质细胞膜表面AQP4水平明显降低，而20％甘露醇却没有此作用。提示3％氯化钠减轻脑水肿、降低颅内压的机制除同20％甘露醇所具有的渗透性脱水机制外还有更重要的非渗透机制的参与。
　　 目的：观察3％氯化钠对细胞膜AQP4蛋白内化的影响。
　　 方法：(1)采用pEGFP-AQP4-M23重组质粒转染U251细胞，建立稳定转染细胞系，通过抗AQP4免疫荧光法鉴定稳定表达AQP4的U251细胞。(2)采用乳酸脱氢酶及MTT比色法观察3％氯化钠对U251细胞的损伤。(3)通过多功能酶标仪、激光共聚焦及流式细胞仪三种方法观察3％氯化钠溶液对U251细胞AQP4内化的影响。(4)通过多功能酶标仪测定3％氯化钠溶液对U251胞内钙离子浓度的影响。
　　 结果：1.成功构建稳定表达AQP4的U251细胞。2.20％甘露醇处理0～30min，细胞培养液中LDH含量及MTT细胞存活率均无明显变化;3％氯化钠处理0～25min，细胞培养液中LDH含量及MTT细胞存活率均无明显变化，当时间延长至30min时，虽细胞培养上清液中LDH含量无明显增加，但细胞存活率与0min相比显著下降(p＜0.05)。
　　 3.20％甘露醇处理0～25min，U251细胞AQP4绿色荧光及细胞膜上抗AQP4抗体红色荧光强度无明显变化。3％氯化钠处理0～25min对U251细胞AQP4绿色荧光强度无明显影响，但在处理5min时即可显著减少细胞膜抗AQP4抗体的红色荧光强度(p＜0.05)，随处理时间延长至15min时细胞红色荧光强度降到最低点;随后随着时间的延长至20min和25min细胞的红色荧光强度有反弹上升;激光共聚焦显微镜下观察到处理前U251细胞的绿色荧光主要集中表达在胞膜，3％氯化钠处理后绿色荧光主要集中在胞浆中;流式细胞仪测定结果显示，3％氯化钠处理前后U251细胞AQP4的绿色荧光强度无明显变化，而U251细胞膜上的抗AQP4抗体的红色荧光及结合有抗体的阳性细胞比率明显下降（p＜0.05）。4.3％氯化钠处理U251细胞15min可引起细胞内钙离子浓度的升高(p＜0.05)。
　　 结论：(1)成功建立稳定表达AQP4绿色融合蛋白的U251细胞。(2)3％氯化钠溶液处理U251细胞25min内不引起细胞膜的损伤和细胞的死亡。(3)3％氯化钠可促进细胞膜上AQP4蛋白的内化，20％甘露醇无此作用。(4)3％氯化钠可提高细胞内钙离子浓度。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一章 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 细胞

1．1．2 试剂

1．1．3 主要仪器及设备

1．1．4 质粒载体、感受态细菌

1．2．实验方法

1．2．1 主要溶液及试剂的配制

1．2．2 质粒pEGFP-AQP4扩增，抽提及验证

1．2．3 U251细胞免疫组化

1．2．4 U251细胞培养液乳酸脱氢酶测定

1．2．5 MTT法检测细胞存活率

1．2．6 pEGFP-AQP4-M23质粒转染U251细胞

1．2．7 多功能酶标仪测定AQP4荧光强度

1．2．8 流式细胞仪测定AQP4绿色荧光及PE标记的抗AQP4抗体的红色荧光

1．2．9 激光共聚焦观察AQP4绿光荧光

1．2．10 细胞内钙离子浓度的测定

1．2．11．统计学分析

第二章 结果

2．1 鉴定pEGFP-AQP4-M23质粒

2．2 鉴定U251细胞株

2．3 建立稳定表达AQP4的U251细胞

2．4 3％氯化钠及20％甘露醇对U251细胞的影响

2．5 3％氯化钠和20％甘露醇对U251细胞及胞膜上AQP4含量的影响

2．6 3％氯化钠对U251细胞AQP4膜蛋白的影响

2．6．1 流式细胞仪观察3％氯化钠对U251细胞AQP4膜蛋白的影响

2．6．2 激光共聚焦观察3％氯化钠对U251细胞AQP4膜蛋白的影响

2．7 3％氯化钠对U251细胞内钙离子浓度的影响

2．8 附图

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述

致谢