Wnt/β-catenin信号通路在腹膜透析腹膜间皮细胞转分化中的作用及机制研究

摘要

研究背景：
　　腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是治疗终末期肾脏疾病(endstage renal disease，ESRD)的重要替代治疗方法之一。但是，长期暴露于高糖腹膜透析液最终可导致腹膜组织纤维化(peritonealfibrosis，PF)，透析效能降低，最终导致超滤衰竭(ultrafiltration faifure，UFF)，严重影响患者的生活质量和长期存活率。近期研究发现，上皮细胞一间充质细胞转分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是腹膜纤维化过程中的触发和始动因素，它可导致腹膜间皮细胞失去间皮细胞的特点，向成纤维细胞转化，产生大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，是腹膜功能退化的关键过程。目前认为，在众多调节间皮细胞EMT的细胞因子和介质中，转化生长因子(transforming growth factorβ，TGF-β)是最关键的因素。但是，目前腹膜纤维化的机制仍未完全阐明，且尚无有效的治疗方式。
　　Wnt蛋白是一类富含半胱氨酸的分泌型脂化糖蛋白，参与调控了器官发育，细胞分化增殖，细胞极性以及细胞迁移。Wnt蛋白通过三条信号通路发挥作用，最经典的为β-catenin介导的Wnt/β-catenin信号通路。近年来的研究显示，Wnt/β-catenin信号通路的异常活化与许多疾病，如肿瘤、遗传性疾病和器官纤维化等相关，并已证明其参与EMT的发生。此外，研究证实Wnt/β-catenin与TGF-β信号交互作用，参与介导了TGF-β诱导多种细胞EMT及纤维性疾病的发生过程。基于以上分析，我们认为，Wnt/β-catenin信号通路参与调控腹膜透析腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化的过程。为此，本研究开展如下。
　　第一章腹透流出液间皮细胞Wnt/β-catenin通路活性与EMT的关系研究。
　　目的：
　　检测腹膜透析患者腹膜透析流出液细胞中Wnt/β-catenin信号通路的表达及EMT发生情况，初步探讨Wnt/β-catenin信号通路与腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化的关系
　　方法：
　　随机选取新开管持续不卧床腹膜透析患者12人，腹透一年以上者12人，分离培养并经流式细胞术鉴定透析流出液细胞。通过Realtime-PCR检测流出液细胞Wnt(1，2，3，3a，4，5a，7b，8a，10a)，β-catenin，DKK1(Dickkopf1)，淋巴样增强结合因子1(Lymphoidenhancer-bindingfactor1， LEF1)，α-肌动蛋白(smooth muscleactin-alpha，α-SMA)，E-钙粘蛋白(E-Cadherin)，胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ，ColⅠ)，纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)，基质金属蛋白酶-7(Matrix Metallo proteinases-7，MMP-7)的表达，Western Blot检测流出液细胞β-catenin，E-Cadherin，α-SMA，COL-Ⅰ的表达。
　　结果：
　　(1)腹透流出液细胞经鉴定为腹膜间皮细胞，且细胞形态出现纤维样改变。(2)透析一年以上组α-SMA，ColⅠ，FN表达明显高于新开管组，E-Cadherin表达明显低于新开管组(3)透析一年以上组Wnt1，Wnt5a，Wnt7b，Wnt8a mRNA表达明显高于新开管组，且β-catenin mRNA及蛋白表达明显高于新开管组(4)透析一年以上组DKK1，LEF1及MMP-7 mRNA表达高于新开管组。
　　结论：
　　随腹膜透析时间延长，Wnt/β-catenin信号通路活性显著升高，腹膜间皮细胞发生EMT改变，提示Wnt/β-catenin信号通路可能与腹膜透析腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化相关。
　　第二章 Wnt/β-catenin信号通路在高糖诱导人腹膜间皮细胞EMT中的作用。
　　目的：
　　探讨Wnt/β-catenin在高糖诱导人腹膜间皮细胞EMT中的作用。
　　方法：
　　用不同浓度（30，60，90mM）高葡萄糖刺激人腹膜间皮细胞株（HMrSV5）细胞不同时间点(0，12，24，48h)，通过免疫荧光、realtimePCR及western blot检测细胞中E-cadherin、α-SMA、ColⅠ、FN及β-catenin、Wnt1，5a、LEF1的表达;转染DKK1质粒，再予60mM高糖刺激，通过细胞免疫荧光、realtime PCR及western blot检测HMrSV5细胞E-cadherin、αt-SMA、ColⅠ、FN及β-catenin、LEF1的表达变化。
　　结果：
　　高糖刺激后，人腹膜间皮细胞E-cadhefin mRNA及蛋白表达降低，α-SMA及ColⅠ、FN mRNA及蛋白表达水平升高;β-catenin、Wnt1，5a、LEF1表达呈时间及浓度依赖性降低。与高糖刺激组相比较，过表达DKK1使β-catenin、LEF1表达下调，E-cadherin表达上调，α-SMA及ColⅠ表达下调;但转染空质粒对高糖诱导的人腹膜间皮细胞β-catenin、LEF1、E-cadherin、α-SMA及ColⅠ的表达变化无明显影响。
　　结论：
　　高糖诱导人腹膜间皮细胞Wnt/β-catenin异常活化;过表达DKK1拮抗Wnt/β-catenin信号抑制高糖诱导人腹膜间皮细胞EMT。
　　第三章 Wnt/β-catenin信号在TGFβ1诱导人腹膜间皮细胞EMT中的作用。
　　目的：
　　探讨Wnt/β-catenin在TGFβ1诱导的人腹膜间皮细胞EMT中的作用。
　　方法：
　　用不同浓度TGFβ1(2.5，5，10ng/ml)刺激HMrSV5细胞，通过免疫荧光、realtime PCR及western blot检测细胞中E-cadherin、α-SMA、ColⅠ及β-catenin、Wnt1，5a、LEF1的表达;转染DKK1质粒及阴性对照空质粒，再予TGFβ1刺激，通过细胞免疫荧光、realtime PCR及western blot检测HMrSV5细胞E-cadherin、α-SMA、ColⅠ及β-catenin、LEF1的表达变化。
　　结果：
　　TGFβ1刺激后，人腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA及蛋白表达水平降低，α-SMA及ColⅠmRNA及蛋白表达水平升高;β-catenin、Wnt1，5a、LEF1 mRNA表达呈浓度依赖性升高。与TGFβ1刺激组相比较，过表达DKK1使β-catenin、LEF1表达下调，E-cadherin表达上调，α-SMA及ColⅠ表达下调;但转染空质粒对TGFβ1诱导的人腹膜间皮细胞β-catenin、LEF1、E-cadherin、α-SMA及ColⅠ的表达变化无明显影响。
　　结论：
　　TGFβ1诱导人腹膜间皮细胞Wnt/β-catenin表达上调;过表达DKK1拮抗Wnt/β-catenin信号抑制TGFβ1诱导人腹膜间皮细胞EMT。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 腹膜透析流出液间皮细胞Wnt／β-catenin通路活性与EMT的关系研究

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

讨论

小结

第二章 Wnt／β-catenin信号通路在高糖诱导人腹膜间皮细胞EMT中的作用

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

讨论

小结

第三章 Wnt／β-catenin信号通路对TGF-β诱导人腹膜间皮细胞株EMT的影响

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

综述 Wnt／β-catenin Signaling：A Promising New Target for Fibrosis Diseases

致谢

攻读博士学位期间研究成果