GPI-PLD过表达释放GPI锚定PSCA对前列腺癌细胞生物学的影响

摘要

目的:
　　 初步研究GPI-PLD基因过表达对前列腺癌PC-3细胞株GPI-PLD酶活性的影响，探讨GPI-PLD释放前列腺干细胞抗原(PSCA)后前列腺癌PC-3细胞株生物学功能的改变，进一步探讨PSCA的生物学功能和在前列腺癌发病过程中的作用与地位，为运用GPI-PLD基因治疗前列腺癌等肿瘤性疾病打下坚实基础。
　　 方法:
　　 1.收集26例正常人外周血血清和18例前列腺癌患者外周血血清，测定其GPI-PLD酶活性。
　　 2.采用梭华-Sofast阳离子聚合物将本实验室已经构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转入前列腺癌PC-3细胞，以转染空载体的pcDNA3.1(+)的PC-3细胞组、未转染的PC-3细胞组为对照，800ug/mL G418筛选出稳定表达的阳性细胞克隆。
　　 3.逆转录酶-PCR(RT-PCR)检测转染前后细胞内GPI-PLDmRNA水平。利用本实验室自制的具有完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶(placental-type alkaline phosphatase，PLAP)作为底物，定量检测稳定转染前后细胞内GPI-PLD酶活性。ELISA法检测各组细胞PSCA的释放情况，流式细胞术检测细胞表面GPI锚定的PSCA表达水平以及细胞周期和凋亡率，细胞计数法测定细胞生长曲线。
　　 结果:
　　 1.前列腺癌患者和正常人对照组外周血血清GPI-PLD酶活性（转化底物PLAP的百分率）分别为29.79％±4.13％和38.27％±5.73％，前列腺癌患者比正常人对照组的GPI-PLD酶活性明显下降，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。
　　 2.RT-PCR结果和GPI-PLD酶活性测定结果表明，稳定高表达GPI-PLD的前列腺癌PC-3细胞系已经建立。①经G418筛选后，稳定转染GPI-PLD的PC-3细胞组GPI-PLD mRNA相对表达量较转染pcDNA3.1(+)的PC-3细胞组和未转染的PC-3细胞组明显增高，GPI-PLD mRNA表达水平（相对灰度值，IA比值）分别为0.976±0.041、0.549±0.032和0.522±0.047，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。②相比转染pcDNA3.1(+)的PC-3细胞组和未转染的PC-3细胞组，稳定转染GPI-PLD的PC-3细胞中GPI-PLD酶活性明显增高，差异有显著统计学意义(P＜0.01)，转染GPI-PLD的PC-3细胞组中GPI-PLD酶活性(转化底物PLAP的百分率)达到24.47％±6.89％，转染pcDNA3.1(+)的PC-3细胞组和未转染的PC-3细胞组GPI-PLD酶活性(％)相对较低，分别为11.63％±6.04％和10.10％±5.38％。
　　 3.ELISA法检测细胞培养基上清中释放的PSCA浓度结果显示，转染GPI-PLD的PC-3细胞组培养基上清中PSCA浓度为146.96±3.32pg/mL，转染pcDNA3.1(+)组和未转染组这一值分别为90.66±3.19pg/mL和89.24±1.77 pg/mL，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。
　　 4.流式细胞术检测细胞表面GPI锚定蛋白质PSCA水平结果显示，相比pcDNA3.1(+)/PC-3细胞组和PC-3细胞组，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3细胞组的平均荧光强度显著降低，有显著性统计学意义(P＜0.01)。GPI-PLD转染组平均荧光强度为59.79±0.92，而其他两对照组分别为85.63±1.30和85.97±1.23。
　　 5.流式细胞术检测细胞周期结果显示，相比pcDNA3.1(+)/PC-3细胞组和PC-3细胞组，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3细胞组的G0-G1显著上升，S期显著下降，G2期略有下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。细胞计数和细胞生长曲线表明，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3细胞组生长速度较pcDNA3.1(+)/PC-3细胞组和PC-3细胞组明显减慢。凋亡结果显示，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3细胞组相对于其他两个组，凋亡值显著上升，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。
　　 结论:
　　 1.前列腺癌患者较正常人的外周血血清GPI-PLD酶活性显著降低，提示前列腺癌患者GPI-PLD基因表达下调。
　　 2.成功构建GPI-PLD基因稳定过表达的前列腺癌PC-3细胞株。
　　 3.GPI-PLD基因过表达能成功释放PC-3细胞膜上GPI锚定蛋白质PSCA，使细胞培养基上清中的失GPI锚定PSCA增加，降低膜表面GPI锚定PSCA的水平。
　　 4.GPI-PLD基因过表达可引起前列腺癌PC-3细胞株细胞周期抑制，增加其凋亡率，抑制细胞生长。

目录

声明

摘要

缩略词汇表

前言

实验技术路线图

第一章 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 细胞株、菌种和重组质粒

1．1．2 主要试剂

1．1．3 主要仪器

1．2 方法

1．2．1 正常人与前列腺癌患者外周血血清GPI-PLD酶活性测定

1．2．2 携带pcDNA3．1(+)／GPI-PLD的TGI大肠杆菌扩增培养及质粒提取

1．2．3 重组质粒pcDNA3．1(+)／GPI-PLD转染PC-3细胞、筛选并鉴定

1．2．4 ELISA检测各组培养细胞上清中可溶性PSCA

1．2．5 FCM检测PSCA膜表面表达水平

1．2．6 FCM检测细胞周期和凋亡率变化

1．2．7 细胞生长曲线测定

1．2．8 统计学分析

第二章 结果

2．1 正常人与前列腺癌患者外周血血清GPI-PLD酶活性测定结果

2．2 质粒提取及酶切结果

2．3 稳定转染GPI-PLD基因后G418筛选结果

2．4 RT-PCR检测GPI-PLD mRNA表达量变化

2．5 各组细胞GPI-PLD酶活性测定结果

2．6 ELISA检测各组细胞PSCA释放水平结果

2．7 流式细胞术测定各组细胞膜表面GPI锚定的PSCA结果

2．8 流式细胞术测定各组细胞周期和凋亡率结果

2．9 细胞生长曲线

第三章 讨论

3．1 GPI锚定蛋白质与前列腺癌

3．2 GPI-PLD过表达对前列腺癌的影响

3．3 针对PSCA靶点在前列腺癌治疗中的作用

第四章 结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间主要的研究成果