定点整合hFⅧ的人胚胎干细胞定向诱导成间充质干细胞的研究

摘要

血友病A(hemophilia A，HA)是X染色体连锁的单基因隐性遗传病，其致病机理是患者有编码人凝血Ⅷ因子(factorⅧ，FⅧ)基因的功能缺陷，目前该病是基因治疗领域的研究热点之一。本研究组前期已经成功利用人核糖体基因区打靶载体(pHmeo)将人凝血因子Ⅷ(hFⅧ)靶入到人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）rDNA区，统一命名为ET5，再拟将ET5分化为适宜血友病A移植的特异组织细胞，以进行血友病A的基因治疗研究。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在自体、同种异体甚至异种异体体内，能有效修复甚至完全重建功能严重受损的组织器官而不被排斥，不易发生恶性转化，已经成为基因治疗及组织修复等领域内的研究热点。已有人量研究表明MSCs可成为血友病A的理想靶细胞。但是成体MSCs取材较困难，而且难以体外长期扩增培养，从而一定程度上限制了MSCs在作为基因治疗靶细胞中的应用。因此本研究拟建立hESCs定向诱导成MSCs的平台，为获取数量足够的MSCs提供新的途径;本研究将以ET5为对象，定向诱导成MSCs，并检测分化后细胞中hFⅧ的表达情况，为后续血友病A基因治疗的临床前研究提供实验基础。
　　 目的:初步建立hESCs定向诱导成MSCs的技术平台，并研究由hESCs定向诱导的MSCs是否与骨髓来源MSCs的特性一致，以及外源基因在ET5诱导的MSCs中的表达情况。
　　 方法:
　　 1.对ET5进行碱性磷酸酶染色检测后，联合bFGF，PDGF-BB等细胞因子诱导ET5向MSCs分化，并进行核型检测;
　　 2.鉴定ET5诱导的MSCs在体外向成骨细胞、软骨细胞和成脂细胞分化的能力;
　　 3.流式分析ET5、ET5诱导的MSCs以及骨髓来源MSCs表面标志物的表达情况;
　　 4.RT-PCR检测ET5诱导成MSCs后Oct4、Sox2和Nanog基因的表达变化;
　　 5.RT-PCR检测由ET5诱导的MSCs中hFⅧ在RNA水平的表达情况。
　　 结果:
　　 1.ET5碱性磷酸酶染色阳性，表明ET5具备多潜能性，将ET5诱导成MSCs后，具有与骨髓来源的MSCs一致的细胞形态，在体外长期培养传代后仍保持核型正常;
　　 2.ET5诱导成的MSCs，在体外仍具备多向分化潜能，可分化成成骨细胞、软骨细胞和成脂细胞;
　　 3.流式分析ET5诱导的MSCs和骨髓来源的MSCs表面标志物表达情况一致;
　　 4.RT-PCR检测定ET5诱导成MSCs后，Oct4、Sox2和Nanog基因表达下调;
　　 5.在ET5诱导的MSCs中可检测到外源基因hFⅧ在RNA水平的表达。
　　 结论:本研究成功将定点整合hFⅧ的hESCs定向诱导成MSCs，并具有较高的诱导效率;外源基因hFⅧ能在定点整合的hESCs诱导而来的MSCs中表达。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

定点整合hFⅧ的人胚胎干细胞定向诱导成间充质干细胞

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

综述

致谢

攻读硕士学位期间主要研究成果