脑胶质瘤中基因的甲基化水平与miR-101介导的组蛋白甲基化修饰机制

摘要

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，生存率低，研究表明，miRNA表达异常、DNA甲基化状态改变、组蛋白修饰等表观遗传机制的异常在脑胶质瘤的发生发展中发挥着重要的作用。本实验室前期采用最新高通量甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）结合启动子区及CpG岛芯片技术，筛选并初步建立脑胶质瘤基因组DNA甲基化谱。通过Massarray、亚硫酸氢盐修饰直接测序法(BSP)等进行检测，发现并验证了LRRC4等9个脑胶质瘤中新的高甲基化基因。通过HPLC-DAD技术对全基因组甲基化分析发现，抑瘤性miR-185可通过直接靶向DNMT1的表达而影响全基因组的甲基化水平，进而调控上述高甲基化基因在脑胶质瘤中的甲基化修饰状态，恢复这些基因在脑胶质瘤中的表达。
　　【确定F10、POTEH、CPEB1、LM03、ELFN2及PRDM16为脑胶质瘤中新的低甲基化基因，其甲基化状态和表达与脑胶质瘤患者的预后密切相关】
　　在上述研究工作基础上，本课题利用Signalmap软件对甲基化芯片筛选出的74个低甲基化基因进行再次筛选，挑选出F10、POTEH、CPEB1、LM03、ELFN2、PRDM16、CD207、BAD、NRBP2、SLITRK5、SLC44A2及PGP等12个基因进行验证。通过BSP方法在大样本脑胶质瘤组织中检测，发现CD207、BAD、NRBP2、SLITRK5、SLC44A2及PGP基因在脑胶质瘤组织（n=6例）中的甲基化程度与正常脑组织（n=4例）无差异;证实F10（n=102例）、POTEH（n=102例）、CPEB1（n=56例）、LMO3（n=56例）、ELFN2（n=56例）及PRDM16( n=56例）基因在脑胶质瘤组织和细胞中发生低甲基化，是脑胶质瘤中新发现的低甲基化基因，这些基因的低甲基化与其在脑胶质瘤中的高表达密切相关。通过对脑胶质瘤患者的跟踪随访发现，这些新发现的低甲基化基因的低甲基化及其在脑胶质瘤中的高表达均可以作为脑胶质瘤患者预后预测的重要标志，低甲基化基因在脑胶质瘤中的甲基化程度越低、表达越高，患者的预后越差。同时。F10基因低甲基化与患者年龄相关;POTEH蛋白高表达及PRDM16基因低甲基化与患者病理分级相关。因此，POTEH基因的高表达和PRDM16基因的低甲基化是脑胶质瘤恶性进展的重要分子诊断标志物，POTEH基因在脑胶质瘤中表达越高或PRDM16基因在脑胶质瘤中的甲基化程度越低，其脑胶质瘤的恶性程度就越高。
　　【miR-101在脑胶质瘤中表达下调或缺失，是脑胶质瘤患者早期发病的重要分子标志物，并与脑胶质瘤患者的预后密切相关，其表达越低，患者预后越差】
　　有文献证实，miR-101在多种肿瘤中表达降低并发挥抑瘤基因的作用。因此，我们用原位杂交的方法进一步检测了脑胶质瘤组织( n=50例)和正常脑组织（n=10例）中的表达，结果证实，miR-101在脑胶质瘤组织中的表达低于正常脑组织，脑胶质瘤I级患者中显著高于其它级别的脑胶质瘤患者，但在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级脑胶质瘤组织中的表达无差异，所以我们认为miR-101的表达下调与脑胶质瘤患者的早期发病密切相关，与脑胶质瘤的恶性进展无关。miR-101在脑胶质瘤组织中的表达与患者的年龄、性别无关。通过对脑胶质瘤患者的跟踪随访发现，miR-101在脑胶质瘤中的低表达可以作为脑胶质瘤患者早期发病和预后预测的重要标志，miR-101在脑胶质瘤中表达越低，患者的预后越差。
　　【低甲基化基因CPEB1、PRDM16和ELFN2是miR-101的直接作用靶基因，miR-10I靶向抑制它们在脑胶质瘤细胞中的表达】
　　许多研究已经证实miRNA在肿瘤中通过调控基因的表达发挥着非常重要的作用。我们设想从miRNA调控靶基因表达的角度来分析低甲基化基因表达上调的机制。于是预测了能调控F10、POTEH、CPEB1、ELFN2、LMO3及PRDM16的miRNA，试图从中找出共同点或某种规律。令我们兴奋的是，在线软件Targetscan6.0预测发现CPEB1、ELFN2、LMO3及PRDM16可以共同受一个miRNA-miR-101的调控。荧光素酶活性检测、real-time PCR和Westem-blot检测表明，miR-101能与CPEB1、PRDM16和ELFN23'UTR结合，并且靶向抑制它们在脑胶质瘤细胞中的表达;miR-101虽不与LM033'-UTR结合，但是仍然可以抑制LM03在脑胶质瘤细胞中的表达。
　　【miR-101靶向抑制EZH2、EED和DNMT3A的表达，下调甲基转移酶活性，抑制LMO3核心启动子区H3K4me2、H3K27me3水平，增加H3K9me3和H4K20me3水平，增加LMO3启动子区甲基化水平，间接抑制LM03在脑胶质瘤细胞中的表达】
　　我们进一步研究miR-101调控低甲基化基因LMO3表达的机制。有文献证实，组蛋白甲基转移酶EZH2是miR-101的直接靶基因，我们通过在线软件Targetscan6.0、miRanda及PicTar预测发现组蛋白甲基转移酶EED及DNA甲基转移酶DNMT3A是miR-101的靶基因，并且证实miR-101在脑胶质瘤细胞中直接抑制EZH2、EED及DNMT3A的表达，miR-101还能抑制胶质瘤细胞中H3K4去甲基化酶、H3K27甲基转移酶、DNMT3A甲基转移酶活性，增加H3K9甲基转移酶和DNMT甲基转移酶活性。鉴于EZH2、EED及DNMT3A具有甲基转移酶活性，我们认为，miR-101极可能通过EZH2、EED及DNMT3A影响组蛋白甲基化修饰。于是，我们检测了miR-101及干扰EZH2、EED及DNMT3A的表达对LM03核心启动子区组蛋白甲基化修饰的影响，发现miR-IOI通过靶向抑制EZH2、EED及DNMT3A的表达抑制LM03核心启动子区H3K27me3和H3K4me2水平，增加H3K9me3和H4K20me3水平，增加LMO3启动子区甲基化水平，间接抑制LMO3在脑胶质瘤细胞中的表达。
　　【miR-101通过靶向EZH2、EED和DNMT3A调控低甲基化基因CPEB1、ELFN2和PRDM16核心启动子区的组蛋白甲基化修饰，影响其甲基化水平，间接抑制它们在脑胶质瘤细胞中的表达】
　　既然miR-101能通过组蛋白修饰调控LMO3的甲基化状态及表达，也可能以同样的机制调控低甲基化基因CPEB1、ELFN2及PRDM16的甲基化状态。因此，我们检测了miR-101和干扰EZH2、EED及DNMT3A的表达对低甲基化基因CPEB1、ELFN2及PRDM16表达以及对其核心启动子区组蛋白甲基化修饰的影响，并检测了miR-101对低甲基化基因CPEB1、ELFN2及PRDM16甲基化状态的影响。通过ChIP结合qRT-PCR、BSP等实验证实miR-101通过靶向EZH2、EED和DNMT3A，降低CPEBI、PRDM16及ELFN2核心启动子区H3K4me2、H3K27me3的水平，增加CPEB1、PRDM16核心启动子区H3K9me3、H4K20me3水平，恢复CPEB1、ELFN2及PRDM16基因启动子区甲基化水平，间接抑制低甲基化基因在脑胶质瘤细胞中的表达。
　　【miR-101通过下调高甲基化基因LRRC4核心启动子区H3K27me3水平，使LRRC4启动子区去甲基化，恢复LRRC4在脑胶质瘤细胞中的表达】
　　LRRC4是我室自主克隆的脑胶质瘤抑瘤基因，并被证实在脑胶质瘤中高甲基化。为了研究LRRC4在脑胶质瘤中的调控机制，我们首先预测了调控LRRC4的miRNA，发现LRRC4是miR-101的预测靶基因，验证发现miR-101并不与LRRC43'UTR结合，但是miR-101能上调胶质瘤细胞中LRRC4的表达并低甲基化LRRC4，抑制EZH2、EED及DNMT3A的表达能抑制LRRC4核心启动子区H3K27me3水平促进表达上调，说明miR-101通过抑制EZH2、EED及DNMT3A的表达，抑制LRRC4核心启动子区H3K27me3水平，使LRRC4启动子区去甲基化，从而恢复LRRC4在脑胶质瘤细胞中的表达。
　　总之，基因的高、低甲基化异常修饰在脑胶质瘤的发生发展中发挥着重要作用，通过检测基因在脑胶质瘤中的高、低甲基化及其表达，可以用于脑胶质瘤的早期诊断和预后预测。miRNA作为一个小片段的RNA，不仅可以直接靶向调控高、低甲基化基因在脑胶质瘤中的表达，也可以通过靶向组蛋白甲基转移酶或DNA甲基转移酶的表达，调节组蛋白甲基转移酶或DNA甲基转移酶活性，影响组蛋白甲基化修饰或DNA甲基化修饰，从而调控基因的甲基化水平和基因的表达。