EB病毒潜伏膜蛋白LMP1通过转录因子EGFR和共因子TIF2调控cyclinD1基因的机制研究

摘要

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)属于受体酪氨酸激酶家族成员，与肿瘤癌变密切相关。我们的前期研究证明在EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）编码的潜伏膜蛋白LMP1(latent membrane protein l)调控下核EGFR可与cyclinD1启动子结合，且其他的蛋白可能参与这一过程。转录中介因子(Transcriptionalintermediary factor2，TIF2)作为一类辅激活因子除与核受体结合外还可与转录因子发生相互作用，同时它也被报道可参与cyclinD1基因转录的精细调控，从而提示我们EGFR与TIF2有可能存在一些新的直接联系。因此本研究以鼻咽癌细胞为模型，以EBV LMP1激活转录因子EGFR和共因子TIF2相互作用调控细胞周期行进为切入点，深入研究EBV LMP1致瘤的分子新机理。
　　 我们以LMP1阴性和LMP1阳性表达的鼻咽癌细胞为模型，利用Real-time PCR、Western blotting、免疫共沉淀、双杂交策略及激光共聚焦技术，对EBV LMP1调控转录因子EGFR和共因子TIF2的转录活化及亚细胞定位进行研究，发现鼻咽癌细胞中EBV LMP1可上调TIF2的蛋白表达并呈剂量依赖性，但对TIF2的mRNA水平没有影响;确定了EBV LMP1调控EGFR和TIF2蛋白相互间形成复合物，且这种相互作用在LMP1的诱导下显著增高，其亚细胞定位在细胞核。
　　 进一步为了探讨LMP1激活EGFR和TIF2相互作用参与转录精细调控的分子机制，我们采用ChIP/Re-ChIP、报告基因分析和点突变技术，结合过表达和RNA干扰手段，初步证实cyclinD1基因启动子区存在EGFR和TIF2共结合位点;从转录水平、蛋白水平和mRNA水平确定EBV-LMP1可调控EGFR和TIF2转录活化靶基因cyclinD1，其可能的调节机制是LMP1促使EGFR结合于cyclinD1启动子区并募集TIF2与其相互作用，激活cyclinD1基因转录;EGFR/TIF2复合物对cyclinD1启动活性的影响主要依赖于基因启动子区ATRS序列。
　　 最后我们采用MTS方法，通过外源性的转入EGFR/TIF2表达质粒和内源性的敲除EGFR/TIF2的表达，证实了EBV LMP1通过调控EGFR和TIF2相互作用提高细胞的生存活性。接着采用流式细胞术结合PI染色法对CNE1/CNE1-LMP1细胞内DNA含量进行检测，发现在EBV LMP1诱导情况下可促进细胞通过G1/S期限制点，加速细胞不成熟地进入S期，同时LMP1的表达可能会导致细胞阻滞于G2/M期。此外，结果还进一步证实LMP1促进细胞周期行进是通过EGFR和TIF2相互作用来实现的。
　　 本课题以鼻咽癌细胞为模型，首次观察到LMP1可调控转录因子EGFR和共因子TIF2呈复合物形式共定位于细胞核;同样首次发现LMP1能促使EGFR结合于cyclinD1启动子区并募集TIF2与其相互作用，以一种合作的方式转录活化cyclinD1基因;其主要的生物学意义在于在加速G1/S期的进程，从而影响细胞周期和细胞生存活性。这一新发现为核EGFR和共因子在细胞周期进程中的作用提供了新的直接联系，同时也为EB病毒致瘤分子机理研究开拓了新的视野。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩写注解

前言

材料与方法

结果

1．确定EBV LMP1调控EGFR与TIF2的相互作用

1．1 EBV LMP1对TIF2 mRNA转录水平无影响但上调TIF2的蛋白表达

1．2 EBV LMP1促进转录因子EGFR与TIF2蛋白在鼻咽癌细胞内复合物形成

1．3 EBV LMP1促使转录因子EGFR和TIF2蛋白共定位于细胞核

2．确定EBV LMP1调控EGFR和TIF2转录活化调节cyclinD1的分子机制

2．1 染色质免疫沉淀技术(ChIP／Re-ChIP)证实cyclinD1基因启动子区存在转录因子EGFR和TIF2共结合位点

2．2 EBV LMP1调控转录因子EGFR和TIF2反式激活cyclinD1启动子活性

2．3 采用siRNA方法分析转录因子EGFR和共因子TIF2对LMP1调控CyclinD1启动子活性的作用

2．4 采用WB法证明LMP1通过调控E6FR和TIF2上调cyclinD1蛋白水平的表达

2．5 siRNA沉寂EGFR和TIF2抑制LMP1调节cyclinD1 mRNA水平

2．6 采用siRNA沉寂EGFR和TIF2对cyclinD1蛋白水平的影响

3 EBV LMP1调控转录因子EGFR和TIF2转录活化cyclinD1的功能

3．1 EBV LMP1调控转录因子EGFR和共因子TIF2活化cyclinD1后，对细胞生存率的影响

3．2 siRNA沉默EGFR和TIF2后，对CNE1／CNE1-LMP1细胞周期全时相的影响

分析与讨论

总结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间的主要研究成果