PPAR β/δ对热预处理血管内皮细胞抗氧化损伤的保护作用及机制研究

摘要

目的：建立血管内皮细胞热损伤模型，检测热损伤预处理后人脐静脉内皮细胞（HUVECs）PPARβ/δ表达的变化，观察PPARβ/δ对热损伤预处理HUVECs抗氧化损伤能力的影响。同时观测HUVECs在热损伤恢复过程中抗凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax、P53、APAF-1表达的变化，探讨PPARβ/δ对Bcl-2表达的影响。
　　方法：⑴分离培养人原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)，分别采用不同的水浴温度(42℃、43℃、44℃、45℃)及处理时间(15min、20min、25min、30min)造成热损伤，以MTT检测细胞存活率，选择使细胞存活率接近50％的热干预温度及时间作为后续实验的热损伤预处理条件。⑵以RT-PCR检测HUVECs在热损伤干预后恢复不同时间(1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h) PPARβ/δ、Bcl-2、P53、APAF-1的mRNA表达变化趋势，对上述受热干预影响变化趋势较为明显的基因以Western-blot检测相应蛋白的表达变化;以HUVECs在热干预恢复过程中PPARβ/δ蛋白达到峰值的时间点组细胞作为HUVECs热损伤模型。⑶HUVECs在热损伤预处理、特异性激动剂GW0742激活PPARβ/δ受体、以及shRNA质粒稳定转染干扰PPARβ/δ表达后，再进行H2O2氧化损伤处理，分别使用Hoechst33258染色、流式细胞计数、DNA-ladder凝胶电泳检测各组HUVECs细胞凋亡率的差异。⑷分别以RT-PCR及Western-blot检测各组HUVECs细胞在热损伤上调PPARβ/δ，或激动剂GW0742激活PPARβ/δ受体及shRNA质粒稳定转染干扰PPARβ/δ表达后，细胞Bcl-2 mRNA及蛋白表达的变化。
　　结果：①MTT结果提示43℃，25min水浴组HUVECs细胞存活率接近50％（0.49±0.06），可作为后续热损伤预处理条件。②RT-PCR结果表明经热损伤干预后HUVECs在恢复过程中PPARβ/δmRNA表达逐步上调，并于48h达到峰值(2.26±0.12 VS.1.0in Control Group，P＜0.01)，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA在热损伤恢复的早期(3h)下调（0.81±0.07 VS.1.0 in Control Group，P＜0.01），但在恢复后期(24h)其表达显著上升(1.46±0.01 VS.1.0 in Control Group，P＜0.01);APAF-1 mRNA在热损伤恢复早期(1h-6h)下调，12h后逐渐恢复正常，而P53 mRNA表达变化不明显。Western-blot检测提示PPARβ/δ蛋白表达在恢复第48h达峰值(3.30±0.13 VS.1.0 in ControlGroup，P＜0.01)。Western-blot检测Bcl-2及Bax蛋白表达水平发现Bcl-2/Bax比值在HUVECs热损伤恢复早期(1h-6h)下降（0.48±0.12in3h Group VS.1.23±0.22 in Control Group P＜0.01），而后期(24h-48h)显著上升(1.85±0.10 in48h Group VS.1.23±0.22 in Control GroupP＜0.01);APAF-1蛋白在热损伤恢复早期（1h-6h）下调（0.46±0.09 in3h Group VS.1.0 in Control Group，P＜0.01），12h后逐步恢复至正常水平。③HUVECs经热预处理或使用PPARβ/δ激动剂GW0742激活PPARβ/δ受体，均可显著降低H2O2诱导的细胞凋亡率:（28.86±8.38％in heat pretreated group VS.39.61±6.16 in H2O2 treated simplygroup,p＜0.01),(33.02±5.12％ in GW0742 pretreated groupVS.39.61±6.16 in H2O2 treated simply group，p＜0.05)。稳定转染PPARβ/δ shRNA质粒则导致HUVECs抗氧化损伤能力降低，细胞凋亡率升高(46.11±5.86％ VS.39.61±6.16 in H2O2 treated simply group,p＜0.05)。④热损伤预处理、GW0742预处理HUVECs均可使细胞Bcl-2蛋白表达增高(1.52±0.27 in heat pretreated group VS.1.0 in ControlGroup, P＜0.01)、(1.98±0.50 in GW0742 pretreated groupVS.1.0 inControl Group，P＜0.01)而HUVECs稳定转染PPARβ/δshRNA质粒后Bcl-2蛋白表达降低（0.24±0.09 VS.1.0in Control Group，P＜0.01），但仅热损伤预处理使HUVECs细胞Bcl-2 mRNA表达升高(1.53±0.11VS.1.0 in Control Group，P＜0.01)，GW0742预处理或稳定转染PPARβ/δ shRNA质粒均对细胞中Bcl-2 rnRNA表达影响不大。
　　结论：⑴成功建立了一种血管内皮细胞热损伤模型，血管内皮细胞在热损伤后一段时间内可恢复正常。⑵热损伤可诱导HUVECs细胞PPARβ/δ表达上调，于第48h达峰值。⑶热损伤可诱导HUVECs抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，其变化趋势与PPARβ/δ相似，Bcl-2/Bax比值在热损伤恢复早期(1h-6h)降低，而在热损伤恢复后期(24h-48h)显著上调;热干预对P53mRNA表达无明显影响。⑷热损伤诱导的PPARβ/δ上调可增强HUVECs抗氧化损伤能力，降低H2O2诱导的细胞凋亡率。⑸PPARβ/δ参与Bcl-2蛋白表达的调节而影响细胞凋亡，但PPARβ/δ对Bcl-2的调控可能为间接的转录后调控。血管内皮细胞（HUVECs）在热损伤后一段时间内可恢复正常，细胞经热损伤预处理后PPARβ/δ表达上调，同时其抗氧化损伤能力增强;热刺激诱导的PPARβ/δ通过上调Bcl-2表达使细胞抗凋亡能力增强为其可能机制之一。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

引言

第一部分 原代HUVECs的培养及热损伤恢复过程中PPAR β／δ及凋亡相关基因表达的变化

摘要

前言

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分 PPAR β／δ对热损伤恢复过程中HUVECs抗氧化损伤能力的影响

摘要

前言

材料与方法

实验结果

讨论

第三部分 PPAR β／δ对Bcl-2的调控及其机制的初步研究

摘要

前言

材料与方法

讨论

全文结论

参考文献

综述一 深度烧伤创面瘀滞区病理生理研究进展

综述二 PPAR β／δ在皮肤的正常发育及创伤修复中的作用及其机制研究进展

致谢

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