HCV NS5A下调抑癌基因GADD45α和PTEN的分子机制及其生物学影响

摘要

H背景和目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)非结构蛋5A(non-structural5A，NS5A)作为HCV的非结构蛋白之一，具有重要的生物学功能。NS5A蛋白参与HCV病毒复制、细胞信号转导、促进细胞增殖、抵抗细胞凋亡等细胞生命活动，与原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生关系密切。HCV NS5A可能通过调节宿主细胞的蛋白表达而致病。生长阻滞和DNA损伤45α基因(Growth arrest and DNA damage45-alpha,GADD45α)作为一个肿瘤抑制基因，参与细胞周期调控阻滞和生长抑制，维持细胞基因组稳定，在维持正常的细胞周期中发挥重要功能。第十号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensinhomolog deleted in chromosome10，PTEN)作为另一种重要的肿瘤抑制基因，通过对细胞内多条信号转导通路的负性调控，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、诱导肿瘤细胞凋亡，维持细胞生长动态平衡。既往临床研究发现，原发性肝癌患者肝癌细胞GADD45α和PTEN表达较正常肝细胞均明显降低，提示GADD45α和PTEN与原发性肝癌的发生密切相关。HCV作为原发性肝癌的主要致病因素之一，其诱导肝癌发生的机制仍不十分清楚。在本课题中，我们研究HCVNS5A对GADD45α和PTEN表达的影响及调控机制，进而探讨GADD45α和PTEN表达异常对HCV感染的肝癌细胞增殖和凋亡的影响，旨在为HCV感染诱发肝癌提供新的实验依据。
　　方法:分别使用荧光素酶试验，相对定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测HCV NS5A对GADD45α和PTEN启动子活性、mRNA转录、和蛋白表达影响。通过p53过表达或针对p53、NF-κB、和PI3K的小分子RNA干扰技术(small interfering RNAs，siRNAs)，研究HCV NS5A对GADD45α表达的调控机制。此外，通过细胞活性试验和克隆形成实验评估GADD45α沉默或GADD45α过表达对肝癌细胞增殖活性的影响。同样，使用小分子化学抑制剂和小分子RNA干扰技术探索HCV NS5A对PTEN表达调控的机制。最后，通过Caspase3/7活性试验和凋亡蛋白评估肝癌细胞在PTEN过表达和Akt活化抑制下的细胞凋亡。
　　结果:HCVNS5A在转录水平，通过下调GADD45α启动子活性，mRNA转录，继而下调GADD45α蛋白表达。P53沉默能使GADD45α表达下调，而p53过表达能废除HCV NS5A对GADD45α的下调作用。HCV NS5A下调P53表达，继而导致下游GADD45α表达降低。进一步实验数据表明HCVNS5A促进NF-κB和Akt磷酸化。使用针对NF-κB和PI3K-Akt的小分子抑制剂或特异性siRNAs，能抵消HCVNS5A对p53和GADD45α的下调作用。另外，HCV NS5A蛋白通过抑制P53进而下调GADD45α蛋白表达，促进肝癌细胞增殖、生长。而GADD45α过表达抑制HCVNS5A诱导的细胞增殖。同样发现，HCV在转录水平，下调PTEN启动子活性，mRNA转录，和PTEN蛋白表达。NS5A蛋白在HCV成熟蛋白中对PTEN下调作用最显著。进一步研究发现HCV NS5A通过ROS途径促进NF-κB磷酸化及非ROS途径激活PI3K-Akt磷酸化抑制PTEN蛋白表达。使用小分子抑制剂和siRNAs抑制NF-κB和PI3K-Akt通路，能废除HCVNS5A对PTEN的下调。此外，PTEN过表达能拮抗PI3K对Akt的活化。而NS5A所致的PTEN表达缺失加强PI3K对Akt活化。缺失的PTEN和活化的Akt共同介导NS5A抑肝癌细胞凋亡过程。
　　结论:HCV NS5A通过下调GADD45α表达继而促进细胞增殖。同时HCV NS5A通过ROS依赖和非ROS依赖途径激活NF-κB和PI3K-Akt磷酸化抑制PTEN蛋白表达，抑制细胞凋亡。这些研究表明HCV NS5A在HCV致肝癌产生中扮演重要角色。