mir-377通过抑制DNMT1促进人皮肤成纤维细胞衰老

摘要

目的:
　　研究miR-377调节DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1)的表达在人皮肤成纤维(Human skin fibroblasts，HSF)衰老中的作用及机制。
　　方法:
　　1.构建皮肤成纤维细胞复制性衰老模型(n=8)（年青组:p3-5，年老组:p25-30），免疫印迹法(Western-Blot)检测人皮肤成纤维细胞传代衰老模型中DNMT、Sirt1等蛋白的表达，并检测衰老相关β-半乳糖苷酶的活性。
　　2.利用DNMT1 siRNA抑制人皮肤成纤维细胞中DNMT1的表达，免疫印迹法(Western-Blot)检测DNMT1、Sirt1等指标的改变，检测衰老相关β-半乳糖苷酶的活性。
　　3.生物信息学网站预测可能与DNMT1的3'UTR区域结合并调控DNMT1的miRNA，初步确定为miR-377能与DNMT1的3'UTR区域结合，可能调控DNMT1的表达。
　　4.使用实时定量PCR(Real-Time PCR)法检测人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型中miR-377的表达。
　　5.构建miR-377的过表达病毒载体及抑制慢病毒载体，使用免疫印迹法(Western-Blot)检测转染后细胞DNMT1，Sirt1等蛋白的表达，检测细胞中β-半乳糖苷酶的活性。
　　6.构建DNMT1的3'UTR上miR-377的结合位点序列（野生型）及其突变序列的荧光素酶报告基因重组载体。以探讨miR-377对 DNMT1表达的影响。
　　7.收集不同年龄避光部位的皮肤，在体内表皮自然衰老模型、成纤维细胞自然衰老模型中验证miR-377及DNMT1的表达。
　　结果:
　　1.人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型中，衰老组与年轻组相比，β-半乳糖苷酶染色率升高(p＜0.001)、Sirt1的表达显著下降(p＜0.05)，说明我们的复制性衰老模型构建成功;DNMT1含量在衰老组的表达明显低于年青组(p＜0.05)。
　　2.DNMT1 siRNA能显著抑制DNMT1的表达(p＜0.05)，siRNA处理组与阴性对照组及空白组相比β-半乳糖苷酶染色率明显升高(p＜0.01)，Sirt1的表达显著下降(p＜0.05)，DNMT1沉默能使细胞出现衰老表型。
　　3.在人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型中，miR-377在衰老组的表达明显高于年轻组(p＜0.05)。
　　4.年轻皮肤成纤维细胞中过表达miR-377可使细胞中β-半乳糖苷酶染色率升高(p＜0.05)，Sirt1表达下降(p＜0.05)，较空白对照组、阴性对照有统计学意义。在衰老皮肤成纤维细胞中抑制miR-377表达可使β-半乳糖苷酶染色率降低(p＜0.05)，Sirt1的表达升高(p＜0.05)，较空白对照组、阴性对照组相比有统计学意义。
　　5、年轻皮肤成纤维细胞中过表达miR-377，miR-377过表达组中DNMT1的表达较空白对照组、阴性对照组明显降低(p＜0.05)。而在衰老细胞中抑制miR-377的表达，miR-377抑制组中DNMT1的表达较空白对照组、阴性对照组明显升高(p＜0.05)。
　　6.荧光素酶实验结果显示:miR-377与DNMT13'UTR区域存在直接相互作用，miR-377能够调节DNMT1的表达。
　　7.体内实验证明，miR-377在衰老皮肤组织表达明显升高(p＜0.05)，DNMT1的表达随年龄增加逐步下降(p＜0.05)。
　　结论:
　　1.DNMT1在皮肤衰老过程中起重要作用。
　　2.miR-377可以通过直接靶向DNMT13'UTR区，调节DNMT1的表达，从而在皮肤成纤维细胞衰老中起重要作用。