阿托伐他汀致胆汁淤积型肝毒性机制研究

摘要

目的：通过考察阿托伐他汀、2-羟基阿托伐他汀酸、4-羟基阿托伐他汀酸对转运蛋白Bsep(bile salt export pump，胆盐输出泵)、Mrp2(multidrug resistance associated protein2，多药耐药相关蛋白2)功能的影响，探讨药物及其代谢物对肝细胞内胆汁相关转运蛋白的影响，从而研究药物引起胆汁淤积型肝毒性可能的机制。
　　方法：⑴使用两步灌流法获得原代肝细胞，台盼蓝染色法选用细胞活性达85％以上的肝细胞用于后续试验。在传统的培养基中，肝细胞无法较好的保持其极性和代谢功能，而“三明治”培养法可以解决这些问题。经过一段时间的培养，肝细胞间形成紧密连接的胆小管网络，肝细胞内的转运蛋白也会表达在相应的细胞膜侧。⑵分离得到的大鼠原代肝细胞采用10％血清的完全培养液进行常规培养24h，用MTT法分别考察曲格列酮、MK-571、阿托伐他汀、2-羟基阿托伐他汀酸、4-羟基阿托伐他汀酸的毒性，考察药物对原代细胞的毒性作用为下一步细胞实验做准备。⑶用阿托伐他汀、2-羟基阿托伐他汀酸、4-羟基阿托伐他汀酸、曲格列酮、MK-571作用于构建的原代大鼠肝细胞模型。CFDA(5-(and6) Carboxy-2，7-dichlorofluorescein diacetate，5(6)-羧基-2，7-二氯荧光素双乙酸盐）、TCA(taurocholic acid，牛磺胆酸)分别为Mrp2和Bsep底物，使用酶标仪检测细胞内CDF(5(and6)-carboxy-2，7-dichlorofluorescein，5(6)-羧基2，7-二氯荧光素）荧光强度，考察待测物对Mrp2蛋白的影响，收集细胞裂解液样本使用LC-MS/MS测定TCA在细胞内外的浓度，用含Ca2+/Mg2+和不含Ca2+/Mg2+中底物浓度计算出胆汁清除率BEI评价药物对Mrp2、Bsep的转运蛋白功能的影响。⑷建立LC-MS/MS测定TCA的方法，用LC-MS/MS测定细胞裂解液中TCA的浓度，考察给药组和对照组Bsep蛋白转运TCA的差异。
　　结果：①平均体重约200g的SD大鼠经两步灌流法获得原代肝细胞，用台盼蓝拒染法检测肝细胞存活率，成活率在85％以上细胞培养24 h，待大部分细胞贴壁后改用无血清培养基。②MTT结果显示曲格列酮、MK-571、阿托伐他汀及其两种活性代谢物对原代肝细胞的毒性作用呈时间依赖性和浓度依赖性。6h的MTT毒性试验结果显示药物各浓度均无明显毒性。12h毒性试验结果显示，MK-571低中高浓度均无显示毒性，曲格列酮作为典型肝毒性药物低浓度(10μmol/L)无明显毒性。24h毒性实验结果显示MK-571、阿托伐他汀及其活性代谢物，4种化合物在低中浓度无明显毒性。由于转运实验中药物作用细胞时间较短，因此曲格列酮选取低浓度，其他药物系列工作液均选取低中高浓度。③阿托伐他汀、2-羟基代谢物增加了TCA在细胞内的蓄积量，并且同时降低了BEI值，说明它们抑制了由Bsep介导的TCA从肝细胞排泄的过程。阿托伐他汀和2-羟基代谢物增加细胞内CDF(由Mrp2转运的底物)蓄积量，降低了胆管内CDF排泄量和BEI值。阿托伐他汀和2-羟基代谢物通过抑制Bsep、Mrp2影响了CDF和TCA在细胞中的分布。
　　结论：阿托伐他汀、2-羟基代谢物对Bsep的底物TCA在细胞内和胆管的蓄积量以及BEI值的产生的影响，以及阿托伐他汀、2-和4-羟基代谢物对CDF在肝胆管内的分布的改变，这与他们对Bsep、Mrp2的抑制作用相关。

目录

声明

摘要

英文词语缩写表

前言

1 大鼠原代肝细胞分离、培养及细胞毒性实验

1．1 仪器与材料

1．1．1 仪器

1．1．2 药品与试剂

1．2 试验方法

1．2．1 大鼠原代肝细胞提取与培养

1．2．2 细胞特性评价

1．2．3 细胞毒性试验

1．3 结果

1．3．1 细胞形态学考察

1．3．2 OD值

1．3．3 细胞存活率

1．4 讨论

2 阿托伐他汀及其活性代谢物对Mrp2功能影响

2．1 仪器与材料

2．2 试验方法

2．2．1 溶液配制

2．2．2 胆管形态观察

2．2．3 不同浓度药物对Mrp2的功能影响

2．2．4 BCA(Bicinchoninic Acid)法测定总蛋白量

2．2．5 CFDA标准曲线

2．2．6 数据处理

2．3 结果

2．3．1 胆管形态学观察

2．3．2 BCA法测定蛋白量

2．3．3 CFDA标准曲线及线性范围

2．3．4 阿托伐他汀及其代谢物对CDF在肝细胞内胆管侧外捧的影响

2．3．5 阿托伐他汀及其代谢物对CDF在肝细胞、胆管分布的影响

2．4 讨论

3 阿托伐他汀及其活性代谢物对Bsep功能影响

第1节 HPLC／MS／MS测定牛磺胆酸的浓度

3．1 仪器与材料

3．2 试验方法

3．3 结果

第2节 阿托伐他汀及其活性代谢物对Bsep功能影响

3．1 仪器材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

4 全文总结

参考文献

综述

攻读学位期间研究成果

致谢