雌二醇与二氢睾酮对血管内皮细胞增殖的影响和机制研究

摘要

目的:1.研究二氢睾酮对不同来源的内皮细胞增殖和迁移的影响;
　　2.探讨二氢睾酮调控内皮细胞增殖的机制;
　　3.研究不同雌激素对雄激素诱导的内皮细胞增殖效应的影响。
　　方法:
　　1.分别用不同浓度二氢睾酮培养人主动脉内皮细胞和小鼠微血管内皮细胞24小时和48小时，MTS检测细胞增殖活力;分别将不同剂量雄激素受体(AR) siRNA或AR抑制剂Casodex与二氢睾酮10nM联合培养人主动脉内皮细胞48小时，分析二氢睾酮诱导的人主动脉内皮细胞增殖与雄激素受体的关系。
　　2.分别收集不同时间段LAPC-4和LNCaP细胞条件培养基(TCM)稀释成不同浓度培养小鼠微血管内皮细胞48小时，MTS法检测细胞增殖活力;用不同剂量二氢睾酮预处理LAPC-4和LNCaP细胞，48小时后收集TCM干预内皮细胞，MTS法检测细胞增殖活力;采用VEGFR抑制剂SU5416联合相应TCM培养内皮细胞24小时或48小时，用MTS方法检测细胞增殖活力;采用MDS法、实时定量PCR法分别检测相应TCM中VEGF-A浓度和细胞VEGF mRNA的表达水平，分析VEGF/VEGFR通路在二氢睾酮诱导的小鼠微血管内皮细胞增殖中的作用。
　　3.细胞实验:单用或合用二氢睾酮、17α-雌二醇或17β-雌二醇培养人主动脉内皮细胞48小时，MTS法检测细胞活力;单用或合用二氢睾酮、17α-雌二醇或17β-雌二醇培养LAPC-4细胞48小时，收集TCM，用MDS法检测TCM中VEGF浓度，并用TCM干预小鼠微血管内皮细胞48小时，MTS法检测细胞活力。
　　动物实验:分别建立LAPC-4和LNCaP细胞异种移植的小鼠模型，将建模成功的小鼠随机分为安慰剂组、17α-雌二醇组和17β-雌二醇组，干预4周后处死小鼠收集移植组织，采用免疫组化法检测血管CD31的表达量，分析雌激素对微血管生成的影响。
　　结果:
　　1.二氢睾酮对不同来源内皮细胞增殖和迁移的影响:二氢睾酮1 nM～50 nM组人主动脉内皮细胞增殖活力较对照组增加，该增殖效应呈时间和剂量依赖性趋势。二氢睾酮对小鼠微血管内皮细胞增殖无明显影响。二氢睾酮10nM组HAECs迁移数较对照组增加(p＜0.01)。
　　雄激素受体介导二氢睾酮诱导的入主动脉内皮细胞增殖:与二氢睾酮10nM相比，Casodex1μM～10μM联合二氢睾酮10nM干预后内皮细胞增殖活力显著降低(p＜0.01);二氢睾酮10nM可显著促进非特异性siRNA转染后人主动脉内皮细胞和对照组细胞的增殖活力(p＜0.01)，对AR siRNA转染后内皮细胞增殖无明显影响(p＞0.05)。
　　2.二氢睾酮通过微环境促进小鼠微血管内皮细胞增殖:LAPC-4和LNCaP细胞TCM可时间和浓度依赖性地诱导小鼠微血管内皮细胞增殖;二氢睾酮0.1nM到50nM预处理后的TCM(DHT-TCM)较对照组TCM内皮细胞增殖活力明显增加(p＜0.05)。
　　二氢睾酮诱导的小鼠微血管内皮细胞增殖与VEGF/VEGFR信号的相关性:收集时间点为24小时和48小时的LAPC-4细胞TCM中VEGF浓度分别是12.43ng/ml和28ng/ml;但DHT-TCM和对照组TCM相比，各组间VEGF浓度差异无统计学意义(p＞0.05)。SU541610μM可完全抑制相应TCM诱导的内皮细胞增殖(p＜0.01)。
　　3.雌二醇联合二氢睾酮对人主动脉内皮细胞增殖的影响:17β-雌二醇联合二氢睾酮组人主动脉内皮细胞增殖活力较单用DHT10nM组显著降低(p＜0.05)，而17α-雌二醇联合组与单用DHT10nM组对比细胞活力无明显差异(p＞0.05)。
　　雌二醇联合二氢睾酮对小鼠微血管内皮细胞增殖的影响:单用或合用二氢睾酮、17α-雌二醇或17β-雌二醇对小鼠微血管内皮细胞增殖无明显直接影响。17α-雌二醇1μM或17β-雌二醇1μM可通过LAPC-4和LNCaP细胞抑制二氢睾酮10nM诱导的小鼠微血管内皮细胞增殖(p＜0.01)。
　　雌二醇对小鼠微血管生成的影响:在LAPC-4异种移植小鼠中，17α-雌二醇组和17β-雌二醇组微血管数目较安慰剂组分别减少18％(p＜0.05)和19％(p＜0.05)，在LNCaP前列腺癌小鼠中微血管数目可分别减少57.7％(p＜0.01)和60.2％(p＜0.01)。
　　结论:
　　1.二氢睾酮对不同来源的内皮细胞增殖具有差异性。
　　2.二氢睾酮可分别通过雄激素受体(AR)和微环境诱导内皮细胞增殖，微环境中VEGFR通路是二氢睾酮诱导的内皮增殖效应的重要通路。
　　3.雌二醇影响二氢睾酮诱导的内皮细胞增殖效应具有差异性。17β-雌二醇，而非17α-雌二醇可抑制雄激素诱导的主动脉内皮细胞增殖。而17β-雌二醇和17α-雌二醇均可通过周围细胞抑制雄激素诱导的小鼠微血管内皮细胞增殖和小鼠异种移植肿瘤内微血管形成。

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

2 二氢睾酮通过雄激素受体促进内皮细胞增殖的研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 统计学方法

2．2 结果

2．2．1 二氢睾酮对不同来源血管内皮细胞增殖的影响

2．2．2 二氢睾酮对人主动脉内皮细胞迁移的影响

2．2．3 雄激素受体在二氢睾酮诱导的内皮细胞增殖中的作用

2．3 小结

3 二氢睾酮通过周围细胞微环境诱导内皮细胞增殖和相关机制探讨

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 实验方法

3．1．3 统计学方法

3．2 结果

3．2．1 周围细胞微环境对小鼠微血管内皮细胞增殖的影响

3．2．2 二氢睾酮通过周围细胞微环境促进内皮细胞增殖

3．2．3 二氢睾酮诱导的内皮细胞增殖与微环境VEGF／VEGFR通路的相关性

3．3 小结

4 雌二醇对二氢睾酮诱导的内皮细胞增殖和小鼠微血管生成的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 实验方法

4．1．3 统计学方法

4．2 结果

4．2．1 雌二醇联合二氢睾酮对内皮细胞增殖的影响

4．2．2 雌二醇可通过微环境抑制二氢睾酮诱导的内皮细胞增殖

4．2．3 雌二醇抑制小鼠异种移植组织内微血管生成

4．2．4 雌二醇联合二氢睾酮对周围细胞VEGF旁分泌的影响

4．3 小结

5 讨论

6 结论

参考文献

综述 雄激素对缺血性疾病血管生成的影响

在读期间取得的主要研究成果

致谢