Hepcidin在非小细胞肺癌中的表达及其促进肺癌细胞增殖生长的研究

摘要

目的:肺癌是世界上最常见的癌症，每年新发病例接近120万，同时也是男性癌症死亡的主要原因。而在女性中，肺癌是第四常见的癌症，也是癌症死亡中排名第二的主要原因.根据组织学形态分类，肺癌可以被分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌两种类型，而非小细胞肺癌在原发肺癌中所占比例超过85％。铁是所有生命细胞基本活动所必需的。很多动物模型和流行病学调查表明，过量的铁是促进恶性肿瘤产生的重要原因之一。研究发现，机体内铁代谢的调控跟Hepcidin关系十分密切。Hepcidin是一种主要由肝脏合成分泌的小分子多肽，在心脏、脑、肺、胰腺等其他组织器官中也有一定的表达。人类Hepcidin由HAMP基因转录并翻译。Hepcidin主要是通过与细胞表面控制铁释放的膜铁转运蛋白Ferroportin的结合，使其被内陷入细胞质中被溶酶体吞噬降解，从而抑制细胞内铁的输出。近来对于Hepcidin在肿瘤中的关系和作用越来越受重视，研究显示Hepcidin在肝细胞癌和肾细胞癌中的表达是下调的，但在结肠癌和乳腺癌中表达却升高。目前尚无相关研究报道Hepcidin与肺癌的关系，因此本课题着重于研究Hepcidin-25在NSCLC患者血液循环中的表达情况，分析Hepcidin和其相关信号通路因子IL-6及BMP在NSCLC患者中的关系;检测Hepcidin在肺癌组织标本中的表达水平，分析其与病理学特征的关系;进一步通过细胞生物学实验分析Hepcidin与肺癌细胞生长情况的关系，并且研究并初步阐明Hepcidin在肺癌细胞增殖生长过程中的作用机制。
　　方法:采用酶联免疫法(ELISA)分别检测53例NSCLC患者和16例健康志愿者的血清Hepcidin-25、IL-6和BMP2的含量水平，分析与肺癌病理学特征之间的关系以及相互之间的关系。通过实时荧光定量PCR检测65例NSCLC患者的肺癌组织样本和正常肺组织样本中的Hepcidin mRNA表达水平;同时用免疫组织化学法检测65例NSCLC组织标本和57例正常肺组织标本中Hepcidin的定位及表达情况。进一步测定了6种NSCLC细胞株和支气管上皮细胞株HBE中Hepcidin mRNA的表达水平，选择表达合适的H520细胞株通过细胞免疫荧光观察Hepcidin在细胞内的表达情况;构建Hepcidin真核表达载体使Hepcidin在HBE细胞内过表达，运用WST-8试验和细胞平板克隆形成试验研究Hepcidin表达水平升高对细胞增殖生长的影响;同时用RNA干扰技术降低H520细胞内Hepcidin的表达，运用WST-8试验和细胞平板克隆形成试验研究Hepcidin表达水平下降对细胞增殖生长的影响;通过WST-8试验检测人工合成Hepcidin结合域（HBD）对H520细胞的影响，分析HBD在肺癌细胞生长过程中的作用。此外还应用荧光测量法检测Hepcidin过表达的HBE细胞和Hepcidin表达下降的H520细胞内的可变铁池(LIP)的变化，进一步阐明Hepcidin促进肺癌细胞增殖生长的机制。
　　结果:NSCLC患者的血清Hepcidin-25显著高于健康志愿者(P=0.004)。NSCLC患者血清Hepcidin-25水平随NSCLC的淋巴结转移的发生而升高(P=0.044);同时，血清Hepcidin-25水平还跟TNM临床分期呈正相关，随临床分期的提高而升高(P=0.017)。通过进一步检测发现IL-6在NSCLC患者和健康志愿者之间没有明显差别(P=0.917)，但是发现IL-6水平在NSCLC患者中随着肺癌淋巴结转移的发生(P=0.018)和TNM临床分期的提高(P=0.041)而下降。血清BMP-2在NSCLC患者中的含量水平要显著高于健康志愿者(P＜0.01);而BMP-2水平跟淋巴结转移的发生(P=0.011)和TNM临床分期(P=0.001)呈正相关。通过spearman's相关系数分析发现，在NSCLC患者中，Hepcidin-25和IL-6含量成负相关(r=-0.242，P=0.049)，而与BMP-2呈正相关(r=0.737，P＜0.001)。
　　实时荧光定量PCR检测发现65例NSCLC患者的肺癌组织标本中有67.7％的Hepcidin mRNA表达高于正常肺组织，只有30.8％低于正常肺组织，仅有1.5％与正常肺组织无差异，说明NSCLC组织标本的Hepcidin mRNA表达升高(P＜0.01);通过Hepcidin mRNA相对于beta-actin的比值（即2-△CT值）进行log10换算标准化进行统计比较也得出肺癌组织标本的Hepcidin mRNA表达升高(P=0.001);此外，分析发现肺癌组织标本中Hepcidin mRNA与肺癌淋巴结转移的发生呈正相关(P=0.041)，并且与血清Hepcidin-25水平呈正相关(r=0.280，P=0.042)。免疫组织化学显示非小细胞肺癌中的Hepcidin阳性表达较正常肺组织明显提高(P＜0.05)。
　　通过实时荧光定量PCR检测发现6种非小细胞肺癌细胞株有4种Hepcidin mRNA较HBE表达升高，仅有2种表达降低。我们选择Hepcidin mRNA表达最高的H520细胞株进行细胞免疫荧光实验，观察发现Hepcidin在H520细胞中显著表达，且主要集中于细胞质及近细胞膜部分。成功构建Hepcidin真核表达载体，并成功将其转入HBE细胞使其稳定高表达Hepcidin;WST-8试验和平板克隆形成试验表明，Hepcidin表达水平提高对HBE细胞的增殖生长有明显的促进作用。使用RNA干扰技术对H520细胞进行Hepcidin基因沉默;WST-8试验和平板克隆形成试验表明，Hepcidin表达水平下降对H520细胞的增殖生长有着明显的抑制作用。用人工合成的HBD对H520细胞增殖生长进行干预后发现，被HBD干预后的H520细胞其增殖生长受到了一定的抑制。荧光测量法检测细胞内的可变铁池(LIP)的结果表明，提高HBE细胞内Hepcidin的表达可以使细胞内铁浓度升高，而降低H520细胞内Hepcidin的表达却使其细胞内铁浓度下降。
　　结论:Hepcidin在非小细胞肺癌患者血清及肺癌组织中表达明显升高，并且与肺癌淋巴结的转移以及临床分期呈正相关。同时，NSCLC患者的血清BMP-2含量明显增加，与肺癌淋巴结转移以及临床分期呈正相关，并与血清Hepcidin-25水平呈正相关，证实了BMP-2可能是调节Hepcidin的关键因素。通过体外细胞实验证实了Hepcidin能够促进肺癌细胞的增殖生长，其与细胞内铁浓度的改变相关，阐述了Hepcidin-Ferroportin-铁这个调控轴对肺癌细胞增殖生长的作用机制。本实验研究认为Hepcidin可以作为肿瘤治疗的一个新的靶点，为肿瘤治疗方法提供新的研究基础和研究思路，此外HBD可能作为一种新的分子药物为肿瘤治疗带来新途径。

目录

声明

摘要

英文缩略词简表

前言

1 Hepcidin-25在非小细胞肺癌患者血清中的表达情况及其与临床病理特征的关系

1．1 前言

1．2 材料

1．2．1 血清标本来源及分组

1．2．2 NSCLC患者的临床及病理学特征

1．2．3 主要试剂和其他材料

1．2．4 主要试剂的配制

1．2．5 主要仪器

1．3 方法

1．3．1 ELISA法测定NSCLC患者血清的Hepeidin-25水平

1．3．2 ELISA法测定NSCLC患者血清的IL-6

1．3．3 ELISA法测定NSCLC患者血清的BMP2

1．3．4 统计学处理

1．4 结果

1．4．1 Hepcidin-25在NSCLC患者和健康志愿者血清中的含量水平比较

1．4．2 Hepcidin-25在NSCLC患者血清中的水平与临床病理学特征之间的关联

1．4．3 血清IL-6在NSCLC患者中的水平及其与血清Hepcidin-25水平的关系

1．4．4 血清BMP-2在NSCLC患者中的水平及其与血清Hepcidin-25水平的关系

1．5 讨论

1．6 结论

2 非小细胞肺癌中Hepcidin基因及蛋白表达的临床研究

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 用于RT-qPCR和免疫组织化学的标本来源

2．2．2 NSCLC患者的临床及病理学特征

2．2．3 主要试剂和其他材料

2．2．4 主要试剂的配制

2．2．5 主要仪器

2．3 方法

2．3．1 RT-qPCR法检测NSCLC和正常肺组织中Hepcidin mRNA的表达水平

2．3．2 免疫组织化学法(IHC)检测NSCLC和正常肺组织中Hepcidin的表达

2．3．3 统计学处理

2．4 结果

2．4．1 组织标本总RNA的鉴定

2．4．2 实时定量PCR结果

2．4．3 Hepeidin mRNA表达与血清Hepeidin-25的关系

2．4．4 免疫组织化学法检测Hepcidin在非小细胞肺癌中的表达情况

2．5 讨论

2．6 结论

3 Hepcidin促进肺癌细胞增殖生长的研究

3．1 前言

3．2 材料

3．2．1 细胞株及来源

3．2．2 菌株和质粒载体

3．2．3 主要试剂和其他材料

3．2．4 主要试剂的配制

3．2．5 主要仪器

3．3 方法

3．3．1 非小细胞肺癌细胞系中Hepcidin mRNA的表达情况

3．3．2 免疫荧光法检测非小肺癌细胞H520的Hepcidin的表达情况

3．3．3 Hepcidin真核表达载体的构建及其稳定表达细胞株的建立

3．3．4 提高Hepcidin表达水平后对HBE细胞增殖生长的影响

3．3．5 siRNA干扰HAMP基因对H520细胞增殖生长的影响

3．3．6 HBD结合Hepcidin后对H520细胞增殖能力的影响

3．3．7 Hepcidin对细胞内可变铁池的影响

3．3．8 统计学处理

3．4 结果

3．4．1 非小细胞肺癌细胞系总RNA的鉴定

3．4．2 非小细胞肺癌细胞系Hepcidin mRNA的表达情况

3．4．3 免疫荧光法检测H520细胞Hepcidin的表达情况

3．4．4 Hepcidin真核表达载体的构建及其稳定表达细胞株的建立

3．4．5 提高Hepcidin蛋白表达水平后对HBE细胞增殖生长的影响

3．4．6 siRNA干扰HAMP基因对H520细胞增殖生长的影响

3．4．7 HBD结合Hepcidin后对H520细胞增殖能力的影响

3．4．8 Hepcidin对细胞内可变铁池的影响

3．5 讨论

3．6 结论

总结论

参考文献

综述 Hepcidin的研究进展及与恶性肿瘤的关系

攻读博士学位期间主要的研究成果

致谢