特异性基因改变的人非小细胞肺癌原代动物模型构建及药物效果评价

摘要

第一章人非小细胞肺癌EGFRL858R+V834L基因突变原代动物模型构建与药物效果评价
　　目的:非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)是严重威胁人类健康的一类癌症。近年来，靶向药物治疗成为NSCLC治疗的重要手段。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是一种酪氨酸激酶(tyrosinekinase，TK)受体，在肿瘤细胞增殖、迁移和分化过程中发挥重要作用。EGFR在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中过表达，过表达与其基因突变密切相关。EGFR基因突变存在于一部分NSCLC患者，以吉非替尼为代表的EGFR酪氨酸激酶抑制剂对这一部分患者具有良好的治疗效果。目前发现的突变位点多位于EGFR基因外显子19和21，多数研究关注单点突变，且多以细胞为研究模型，不能准确模拟在体环境。本研究首次建立EGFR蛋白L858R+V834L双突变位点的皮下移植瘤小鼠模型，并观察吉非替尼在这一模型中的治疗效应。
　　方法:肿瘤标本来源于湖南省长沙市中南大学湘雅二医院手术患者，女性，54岁，中-低分化腺癌。基因分型确定其EGFRL858R+V834L双基因突变阳性。原代肿瘤组织被剪成1.0～1.5mm3大小。雌性SCID小鼠背部皮下选取四个点接种瘤块，每点两块，此为第一代荷瘤小鼠(P1)。当某一点的皮下移植瘤直径大于1cm时，处理小鼠，剥离肿瘤按上述方法接种第二批SCID小鼠(P2)，并重复上述步骤进行肿瘤传代，建立第三代、第四代荷瘤小鼠。四代小鼠肿瘤组织以EGFR基因突变L858R特异性抗体，采用免疫组织化学法和免疫印迹方法检测EGFR表达。DNA从肿瘤组织获得经PCR后产物送测序。第三代小鼠接种后，当瘤体直径达4-5mm时，选取5只小鼠给予吉非替尼治疗2周，5只作为溶媒对照，每三天测量肿瘤大小，计算体积，判断吉非替尼疗效。
　　结果:1.成功建立移植瘤模型，P1、P2、P3和P4小鼠移植瘤成功率分别为50％、50％、100％和87.5％。
　　2.免疫组织化学和免疫印迹法确证，各代移植瘤EGFRL858R蛋白表达均呈阳性。
　　3.基因测序显示，各代移植瘤EGFR基因21外显子均存在L858R+V834L双突变位点，确证其与原代肿瘤序列一致。
　　4.吉非替尼治疗部分抑制L858R+V834L双突变移植瘤体的生长。
　　结论:本实验首次成功构建EGFR基因L858R+V834L双突变位点的移植瘤小鼠模型，且基因型在传代过程中保持一致;该模型对吉非替尼治疗敏感，可作为NSCLC患者EGFR基因突变阳性靶向药物筛选的模型。
　　第二章人非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因原代动物模型及crizotinib获得性耐药模型的构建
　　目的:靶向治疗是非小细胞肺癌(NSCLC)的重要治疗手段，近年来陆续发现多种新的治疗靶点。ALK（Anaplasticlymphomakinase，间变性淋巴瘤激酶）融合基因，特别是EML4-ALK融合基因是当前NSCLC靶向治疗的新研究热点。以Crizotinib为代表的ALK抑制剂在临床应用取得了较好的疗效，大多数ALK融合基因阳性的NSCLC病人对Crizotinib敏感，但最后不可避免地在一年之内因出现耐药而复发，部分机制不明，还有患者可有多重耐药出现，出现另一些激酶的活化如EGFR和其他酪氨酸激酶受体活性的增加，使得耐药的具体机制更为复杂。已知Akt和ERK等信号通路，特别Akt和ERK磷酸化水平与ALK调控细胞生存与凋亡密切相关，也参与了crizotinib耐药的发生。本研究将利用皮下移植瘤技术建立原代非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因小鼠，以此为模型，诱导crizotinib获得性耐药的发生，为寻找新型克服Crizotinib抵抗的ALK抑制剂，为临床ALK融合基因肺癌Crizotinib获得性耐药患者的治疗提供实验依据。
　　方法:肿瘤标本来源于湖南省长沙市中南大学湘雅二医院手术患者，男性，40岁，左上肺腺癌，低分化。基因分型确定其EML4-ALK融合基因阳性。原代肿瘤组织被剪成1.0～1.5mm3大小。雌性SCID小鼠背部皮下选取四个点接种瘤块，每点两块，此为第一代荷瘤小鼠(P1)。当某一点的皮下移植瘤直径大于1cm时，处理小鼠，剥离肿瘤按上述方法接种第二批SCID小鼠(P2)，并重复上述步骤进行肿瘤传代，建立第三代荷瘤小鼠。三代小鼠肿瘤组织以ALK特异性抗体，采用免疫组织化学法和免疫印迹方法检测ALK表达。RNA从肿瘤组织获得经RT-PCR后产物送测序。第三代小鼠接种后，当瘤体直径达8-9mm时，选取6只小鼠给予Crizotinib治疗2周，6只作为溶媒对照，每三天测量肿瘤大小，计算体积，判断crizotinib疗效。另有耐药组10只持续给药6个月诱导耐药形成，提取肿瘤组织蛋白检测相关蛋白磷酸化水平的变化。
　　结果:1.成功建立移植瘤模型，P1、P2和P3小鼠移植瘤成功率分别为50％、100％、和86.7％。
　　2.免疫组织化学和免疫印迹法确证，各代移植瘤EML4-ALK融合蛋白表达均呈阳性。
　　3.基因测序显示，各代移植瘤EML4-ALK融合基因表达呈阳性。
　　4.Crizotinib治疗2周显著抑制EML4-ALK融合基因移植瘤体的生长。
　　5.Crizotinib治疗6月产生获得性耐药，耐药肿瘤组织Akt和ERK磷酸化水平升高。
　　结论:本实验成功构建非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因的移植瘤小鼠模型，且基因型在传代过程中保持一致;该模型对Crizotinib敏感并可诱导耐药的产生，可作为Crizotinib耐药性研究的模型。

目录

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摘要

英文缩写注释

第一章 人非小细胞肺癌EGFR L858R+V834L基因突变原代动物模型构建与药物效果评价

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．附图

5．讨论

6．结论

第二章 人非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因原代动物模型及crizotinib获得性耐药模型的构建

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．附图

5．讨论

6．结论

参考文献

综述 表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼治疗非小细胞肺癌的临床研究进展

综述二 非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因及其研究进展

攻读学位期间主要研究成果

致谢