Pandoraea sp.B-6和Cupriavidus basilensis B-8降解碱木质素及其模型苯化合物的机制研究

摘要

木质素是地球上最丰富的苯化合物。自然界中由木质素构成的生物量仅次于纤维素和半纤维素位于地球生物总量的第二位。木质素结构复杂，相对分子量高，难溶于水，这些特点使其很难被降解。木质素的微生物降解已经成为国内外研究的热点，而且微生物主要集中于真菌。近年来越来越多的研究表明，由于具有极强的环境适应性和丰富的生化多样性，细菌将在木质素生物降解中起到越来越重要的作用。
　　论文以碱木质素及木质素模型苯化合物为对象，利用从被微生物腐蚀的三国吴简的浸泡液中分离的Pandoraea sp.B-6和Cpriavidusbasilensis B-8对木质素及其模式苯化合物降解的特性和机制进行了比较系统的研究，获得如下研究成果:
　　系统研究了Pandoraea sp.B-6和Cupriavidus basilensis B-8的木质素降解特性，首次发现Pandoraea属和Cupriavidus属的菌株具有木质素降解能力。两株细菌降解碱木质素的最适pH和温度分别为10，30℃和7，30℃;两株细菌在初始浓度为1-6g/L的碱木质素培养基中COD和色度分别降低38.2％，41.6％和31.3％，37.5％以上。两株细菌分泌胞外过氧化物酶降解木质素，其中Pandoraea sp.B-6中锰过氧化物酶和漆酶的最大活性分别为2249.2 U/L和1120.6 U/L，Cupriavidus basilensis B-8中锰过氧化物酶和漆酶的最大活性分别为1685.3U/L和815.6U/L。通过GC-MS分析两株细菌降解碱木质素过程中产生的中间代谢物，发现有多种化合物（如阿魏酸、肉桂酸等），由此推测两株细菌首先将木质素解聚成低聚物，然后进一步降解成木质素单体苯化合物及其他小分子化合物直至进入三羧酸循环被矿化。
　　Pandoraea sp.B-6和Cupriavidus basilensis B-8在以阿魏酸和对香豆酸为唯一碳源的培养基中正常生长的同时还能够高效的降解这两种化合物。除了Pandoraea sp.B-6降解对香豆酸的最适pH为8以外，两株细菌降解这两种化合物的最适pH和温度均分别为7和30℃，完全降解这两种苯化合物的最大浓度分别为1000mg/L，800mg/L和1000mg/L，1000mg/L。通过两株细菌降解苯化合物的液相色谱分析，在Pandoraea sp.B-6和Cupriavidus basilensis B-8降解对香豆酸的过程中只发现对羟基苯甲酸这一种中间产物（最大浓度分别为169mg/L和253mg/L）;在Pandoraea sp.B-6降解阿魏酸的过程中发现了香草酸和香草醛，最大浓度分别为426mg/L和193mg/L;在Cupriavidusbasilensis B-8降解阿魏酸的过程中发现了4-乙烯基愈创木酚，香草酸和香草醛，最大浓度为别为548mg/L，238mg/L和低于30mg/L。通过基因RT-PCR(逆转录PCR)分析发现两株细菌都是通过β-酮中心代谢途径对两种苯化合物进行降解，而Cupriavidus basilensis B-8中还存在另外一条降解阿魏酸的途径—还原转化途径。
　　准确测定了Pandoraea sp.B-6和Cupriavidus basilensis B-8的全基因组序列。结果发现，这两株细菌的基因组均具有单染色体，大小分别为5037162bp(136 contigs)和8705938bp(1458 contigs)。平均GC含量分别为63.56％和65.40％。两株细菌基因组编码区的GC含量（分别为64.02％和65.62％）均比非编码区的GC含量（分别为60.08％和64.29％）高。Pandoraea sp.B-6基因组中共有4803个编码序列，总长度为4312731bp，其中包括4692或4695个蛋白编码基因，55个代表20种氨基酸的tRNA编码基因，5个核糖体RNA编码基因，3个或5个rRNA编码基因，31个sRNA编码基因以及15个miRNA编码基因。Cupriavidus basilensis B-8基因组中共有8448个编码序列，总长度为6740730bp，其中包括8371个蛋白编码基因，65个代表20种氨基酸的tRNA编码基因，5个核糖体RNA编码基因，12个rRNA编码基因。
　　对两株细菌的基因组及特定的表达蛋白进行系统的生物信息学分析和RT-PCR分析。结果发现:Pandoraea sp.B-6和Cupriavidusbasilensis B-8均含有多种降解木质素及苯化合物的基因和降解途径。Pandoraea sp.B-6共发现119个木质素及苯化合物降解相关基因;四种木质素降解相关途径:β-酮中心代谢途径降，龙胆酸代谢途径，2，3-二羟基苯基丙酸间位裂解途径和Box途径;以及5种其他苯化合物降解途径:3，4-二羟基苯乙酸甲酯间位裂解途径，苯基乙酰辅酶A开环途径，2，5-二羟基苯乙酸途径，2-氨基苯甲酰基-辅酶A途径和3-羟基邻氨基苯甲酸途径。Cupriavidus basilensis B-8共发现165个木质素基本化合物降解相关基因;5种木质素降解相关途径:β-酮中心代谢途径，苯酚代谢途径，龙胆酸代谢途径，2，3-二羟基苯基丙酸间位裂解途径和Box途径;以及5种其他苯化合物降解途径:3，4-二羟基苯乙酸甲酯间位裂解途径，苯基乙酰辅酶A开环途径，2，5-二羟基苯乙酸途径，2-氨基苯甲酰基-辅酶A途径和3-羟基邻氨基苯甲酸途径。
　　研究结果证实了Pandoraea sp.B-6和Cupriavidus basilensis B-8具有降解木质素及其模型苯化合物的能力。全基因组的测序和分析确定了这两株细菌降解木质素和苯化合物的步骤和降解产物。研究对木质素及苯化合物降解机制及木质素降解应用研究具有重要意义。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 木质素的结构和性质

1．1．1 元素组成

1．1．2 官能团

1．1．3 结构组成及连接方式

1．1．4 木质素的性质

1．2 木质素模型苯化合物的特征

1．2．1 木质素模型苯化合物的种类

1．2．2 木质紊模型苯化合物的分布

1．2．3 木质素模型苯化合物的连接方式

1．3 木质素及其模型苯化合物的微生物降解

1．3．1 白腐真菌和褐腐真菌的木质素降解

1．3．2 真菌的木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶

1．3．3 木质素及其模型苯化合物降解相关的胞外漆酶

1．3．4 木质素及其模型苯化合物降解细菌及其相关酶类

1．3．5 木质素降解的小分子产物

1．4 木质素及其模型苯化合物的降解机制

1．4．1 β-芳基乙醚降解途径

1．4．2 联苯降解途径

1．4．3 二芳基丙烷降解途径

1．4．4 木质素组分苯基香豆满和松脂醇降解途径

1．4．5 木质素组分苯基香豆满和松脂醇降解途径

1．4．6 原儿茶酸氧化裂解

1．4．7 革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中存在的木质素及模型苯化合物降解机制

1．5 研究目的与思路

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究思路

1．5．3 论文创新点

第二章 碱木质素微生物降解的特性

2．1 实验材料与方法

2．1．1 实验菌株及相关培养基

2．1．2 实验主要试剂及仪器

2．1．3 细菌培养条件

2．1．4 细菌的生长和木质素降解试验方法

2．1．5 培养基的色度脱除实验

2．1．6 木质素降解酶的酶活测定

2．1．7 GC-MS分析

2．1．8 扫描电镜分析

2．2 结果与讨论

2．2．1 温度对细菌降解木质素的影响

2．2．2 pH对细菌降解木质素的影响

2．2．3 细菌的生长和碱木质素的降解

2．2．4 碱木质素无机盐培养基中的色度脱除

2．2．5 碱木质素降解相关的胞外酶

2．2．6 碱木质素代谢产物的GC-MS分析

2．2．7 细菌降解碱木质素的微观过程

2．3 小结

第三章 木质素模型化合物的微生物降解

3．1 实验材料与方法

3．1．1 实验菌株及相关培养基

3．1．2 实验主要试剂及仪器

3．1．3 降解菌株的培养

3．1．4 细菌的生长和苯化合物的降解

3．1．5 液相分析

3．1．6 紫外分析

3．1．7 反向PCR(RT-PCR)分析

3．2 结果与讨论

3．2．1 温度对细菌降解苯化合物的影响

3．2．2 pH对细菌降解苯化合物的影响

3．2．3 不同初始浓度对细菌生长及降解苯化合物的影响

3．2．4 细菌降解苯化合物的产物分析

3．2．5 降解苯化合物相关基因的RT-PCR分析

3．3 小结

第四章 Pandoraea sp．B-6和Cupriavidus basilensis B-8基因组测序

4．1 实验材料与方法

4．1．1 微生物基因组提取

4．1．2 测序策略

4．1．3 原始数据的处理

4．1．4 数据组装分析

4．1．5 基因组装结果评价

4．1．6 基因预测

4．1．7 重组序列分析

4．1．8 ncRNA预测

4．1．9 基因功能注释

4．1．10 基因组全部信息作图

4．1．11 共线性分析

4．2 基因组测序及分析

4．2．1 基因组序列原始数据的处理

4．2．2 基因组数据组装及组装结果分析

4．2．3 基因预测

4．2．4 重复序列分析

4．2．5 ncRNA预测

4．2．6 基因功能预测

4．2．7 基因组全部信息作图(环形图)

4．2．8 共线性分析

4．3 小结

第五章 Pandoraea sp．B-6木质素及其模型苯化合物降解机制

5．1 实验材料与方法

5．1．1 苯化合物为唯一碳源培养Pandoraea sp．B-6

5．1．2 Pandoraea sp．B-6基因组序列的比较分析

5．1．3 RT-PCR分析

5．2 木质素降解的分子生物学机制

5．2．1 木质素降解初级阶段胞外酶分析

5．2．2 构成木质素的苯化合物的完全降解途径

5．3 其他苯化合物降解的分子生物学机制

5．3．1 3，4-二羟基苯乙酸甲酯间位裂解途径

5．3．2 C6-C2和C6-C3化合物的降解

5．3．3 氨基化合物的降解途径

5．4 小结

第六章 Cupriavidus basilensis B-8木质素及其模型苯化合物降解机制

6．1 实验材料与方法

6．1．1 苯化合物做为唯一碳源培养Cupriavidus basilensis B-8

6．1．2 Cupriavidus basilensis B-8基因组序列的比较分析

6．1．3 RT-PCR分析

6．2 木质素降解的分子生物学机制

6．2．1 木质素降解初级阶段胞外酶分析

6．2．2 构成木质素的苯化合物的完全降解途径

6．3 其他苯化合物降解的分子生物学机制

6．3．1 3，4-二羟基苯乙酸甲酯间位裂解途径

6．3．2 C6-C2和C6-C3化合物的降解

6．3．3 氨基化合物的降解途径

6．4 小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．1 建议

参考文献

攻读博士学位期间的学术成果

致谢