清火败毒饮通过HSP70拮抗烧伤后肠粘膜凋亡机制研究

摘要

目的:在动物体内和体外研究清火败毒饮对烧伤后肠粘膜组织中Hsp70/p-Akt通路表达水平及凋亡相关因子Caspase-3的影响，探讨上述因素对烧伤后肠粘膜可能的保护机制。
　　方法:选择健康SD大鼠136只，随机分为正常组（又称对照组）、单纯烧伤组（简称烧伤组）、烧伤后QHBDY治疗组（简称治疗组），治疗组根据清火败毒饮灌喂剂量不同分为0.5ml/100g，1ml/100g，1.5ml/100g三组。于烧伤后6小时，12小时，24小时以及48小时采集小肠组织标本，用TUNEL法分析小肠粘膜组织细胞的凋亡率，运用Real time PCR技术和IHC技术检测肠粘膜组织中Hsp70、Caspase-3的表达情况。构建Hsp70-pZsGreen卜C1真核表达载体，将其转染入IEC-18细胞，用Western blot的方法观察转染后12小时，24小时，48小时和72小时Hsp70和p-Akt的表达情况。用FCM术检测Hsp70转染后对细胞凋亡率的影响，用Caspase-3分光光度法检测Hsp70转染后对细胞Caspase-3活性的影响。在细胞水平的研究先对烧伤血清的浓度和药物浓度以及处理时间进行了摸索，根据细胞存活率确定最佳浓度和处理时间。分别用烧伤血清和（或）中药对细胞进行干预，用FCM术检测干预后细胞凋亡率的变化，用Caspase-3分光光度法检测干预后细胞Caspase-3活性的变化，用Western blot的方法检测在烧伤血清和药物的共同作用下Hsp70的表达情况。
　　结果:烧伤后SD大鼠小肠粘膜细胞的凋亡率明显增加。1ml/100g和1.5ml/100g治疗组的凋亡率比烧伤组低。烧伤后SD大鼠小肠粘膜组织中Hsp70在mRNA水平和蛋白水平的表达均增加，Caspase-3在蛋白水平的表达增加。1.5ml/100g治疗组与烧伤组相比，Hsp70和Caspase-3在蛋白水平的表达均存在统计学差异(P＜0.05)。细胞转染后，p-Akt蛋白表达随Hsp70蛋白表达的增加而增加，两者呈正相关。而Caspase-3的相对活性和细胞凋亡率降低。MTT的结果显示，烧伤血清和清火败毒饮对IEC-18细胞存活率的影响均存在浓度效应和时间效应。在烧伤血清和清火败毒饮共同作用下，与烧伤血清组相比，凋亡相关因子Caspase-3蛋白相对活性降低，凋亡率也降低。Western blot相对定量结果显示，治疗组与烧伤血清组相比，Hsp70的表达增加。
　　结论:烧伤后肠粘膜中Hsp70在mRNA水平和蛋白水平的表达均增加，发挥应激保护作用。清火败毒饮可能通过上调烧伤后大鼠体内Hsp70的表达，降低Caspase-3的表达，降低凋亡率，从而发挥其抗凋亡作用。Hsp70蛋白的表达能促进p-Akt蛋白的表达，降低Caspase-3的蛋白活性，同时降低细胞的凋亡率。清火败毒饮对烧伤血清作用后的IEC-18细胞可能具有保护作用，上调Hsp70蛋白的表达，使凋亡相关因子Caspase-3蛋白的相对活性降低，凋亡率也降低。