OCTN2转运蛋白的表达调控与增强肿瘤细胞系对奥沙利铂敏感性的机制研究

摘要

新型阳离子转运体2(organic cation transporter-2，OCTN2)是由位于染色体5q31的溶质载体家族基因5（SLC22A5）编码的一种转运有机阳离子、兼性离子和肉毒碱的转运体，包括10个外显子和9个内含子。和其他SLC22家族蛋白一样，预测的拓扑结构显示OCTN2具有12α-螺旋的穿膜结构域（TMDs），一个N端胞内环，一个位于TMD1和2之间的胞外糖基化环，一个位于TMD6和7之间的磷酸化大胞内环，一个胞内羧基C末端。许多药物已被证明是OCTN2的底物或抑制剂，因此，OCTN2的表达调控、基因突变等因素直接影响这些药物的吸收、分布和排泄，最终影响疗效和毒性。
　　奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)，左旋反式二氨己烷草酸铂，是第三代铂类化疗药物，主要用于治疗Ⅱ期，Ⅲ期和Ⅳ期结直肠癌。奥沙利铂对肿瘤细胞毒性主要通过与DNA结合，导致一系列生化级联反应，最终促进细胞死亡。为揭示这一机制，目前多数研究主要关注奥沙利铂对细胞生长和凋亡靶基因及相关通路的影响。对于细胞水平控制奥沙利铂摄取和外排机制研究仍然较少。奥沙利铂药代动力学的研究对于增加药物疗效和减少副作用亦十分关键。研究发现在过表达OCTN2的HEK293转染细胞系中，奥沙利铂在细胞质的累积和细胞毒性作用显著性增加，表明奥沙利铂是其良好底物。
　　有文献报道核受体PPARγ和PPARα能调控OCTN2表达。由于PPARγ和PPARα在不同组织中的分布以及表达量的差异，OCTN2是受PPARγ或PPARα调控存在组织特异性。在结直肠中，由于PPARγ的高表达，OCTN2是通过PPARγ来调控。进一步荧光素酶报告基因实验和凝胶迁移率实验(EMSA)证明，PPARγ能与RXRα形成的异源二聚体，被配体激活后结合到OCTN2内含子1的PPRE顺式作用元件，转录激活OCTN2的表达。基于以上的理论，我们以PPARγ/RXRα二聚体为受体靶点，载有OCTN2/PPRE序列的荧光素酶报告基因的转染质粒(pGL4.17)以及细胞系COS-7，建立筛选OCTN2诱导剂的细胞模型。
　　PPARγ是治疗糖、脂代谢疾病的重要靶点。研究表明一些中药可以明显改善糖尿病及其并发症。因此，很有可能从治疗糖、脂代谢疾病的中草药中筛选出新的作为PPARγ配体的天然化合物。应用我们构建的基于PPARγ介导的OCTN2诱导剂筛选细胞模型，从天然化合物中筛选和评估OCTN2天然诱导剂。我们发现天然诱导剂木犀草素通过PPARγ的激动作用诱导肿瘤细胞系中OCTN2的表达，靶向性地增强其对底物奥沙利铂的转运和细胞内浓度的累积，促进了肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性。
　　DNA甲基化主要是指DNA的5'胞嘧啶甲基化，是一种重要的调控基因表达的表观调控机制。在靠近转录起始位点附近的启动子区域，CpG双核苷酸大量聚集，称之为CpG岛。癌症相关基因启动子区CpG岛的高甲基化与基因沉默有关，如多种癌基因，抑癌基因，细胞周期调控基因，信号转导基因，凋亡相关基因和DNA损伤修复基因等。DNA甲基化可能调控药物转运体表达，从而影响药物吸收和排泄，与药物疗效、耐药和毒性反应密切相关。与DNA变异不同的是，DNA甲基化能被去甲基化试剂所逆转，例如地西他宾(5-aza-2'-deoxycytidine，DCA)和阿扎胞苷(5-aza-citidine)。有研究发现5-aza-cytidine能上调上皮细胞肿瘤细胞系中的OCTN2表达。因此，我们对OCTN2在肿瘤细胞中的差异性表达与启动子甲基化状态的相关性进行了分析。通过甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸盐处理后PCR测序(BSP)，以及体外甲基化实验，发现OCTN2 CpG岛1的启动子活性及甲基化对启动子活性的影响。应用去甲基化剂能逆转OCTN2启动子高甲基化状态，增加其表达，促进其底物奥沙利铂的摄取和肿瘤细胞系对奥沙利铂敏感性。
　　OCTN2基因突变和基因多态性(SNP)与原发性肉毒碱缺失症、炎性肠疾病和克罗恩病相关。OCTN2的两个多态性位点(rs2631367and rs2631372)已经被证实与伊马替尼治疗胃肠道间质瘤患者的生存率相关。许多研究已经表明突变影响OCTN2对底物L-肉毒碱摄取，然而对其他阳离子底物的研究仍然较少。我们总结了OCTN2的所有具有功能意义突变，从中选择四个具有典型意义的功能性突变，并且在体外应用突变载体转染细胞系构建了表达OCTN2突变体的重组细胞系。研究突变对OCTN2表达和功能的影响，进一步考察这些突变对OCTN2摄取奥沙利铂的影响。
　　本课题的主要研究结果如下:
　　1.成功建立一种基于荧光素酶报告基因的OCTN2转运体诱导剂的细胞筛选模型。
　　2.应用OCTN2诱导剂筛选模型发现了5种OCTN2潜在诱导剂，包括木犀草素、山奈酚、姜黄素、葛根素和丹酚酸B。
　　3.木犀草素通过激动PPARγ/RXRα受体，调控OCTN2表达和功能，促进OCTN2介导的SW480细胞对奥沙利铂的敏感性。
　　4.启动子甲基化调控OCTN2在不同肿瘤细胞系中的差异性表达。
　　5.F17L和P478L错义突变能够改变OCTN2对奥沙利铂的摄取，从而影响OCTN2介导的奥沙利铂敏感性。
　　本课题在细胞分子水平探讨了药物转运体OCTN2表达调控机制，包括DNA错义突变，核受体PPARγ的转录水平调控，DNA甲基化的表观调控等。我们研究目的是为了揭示这些调控对OCTN2表达和功能的影响，以及对其底物奥沙利铂转运作用的影响。这些调控或许能增加肿瘤细胞中OCTN2表达或者功能，进一步靶向性增加奥沙利铂摄取和在细胞内的累积，促进肿瘤细胞敏感性和细胞凋亡。OCTN2有可能成为药物基因组学预测奥沙利铂疗效的一个新的遗传标志物。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 OCTN2诱导剂筛选模型的建立

摘要

Abstract

研究背景

1．仪器与材料

2 方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第二章 OCTN2天然化合物诱导剂的筛选

摘要

Abstract

研究背景

1．仪器与材料

2．方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第三章 木犀草素通过PPARγ／OCTN2通路增加SW480细胞系对奥沙利铂敏感性

摘要

Abstract

研究背景

第一节 HPLC检测奥沙利铂浓度

1．材料和仪器

2．方法

3．结果

第二节 木犀草素对OCTN2表达和功能的影响

1．材料与仪器

2．方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第四章 启动子甲基化状态差异性在不同肿瘤细胞系中对OCTN2的表观调控

摘要

Abstract

研究背景

1．仪器与材料

2．方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第五章 OCTN2突变对奥沙利铂转运的影响

摘要

Abstract

研究背景

1．仪器与材料

2．方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

综述 有机阳离子转运体OCTs家族表达调控和药物基因组学研究进展

攻读学位期间主要成果

致谢