Tivozanib抑制ABCB1和ABCG2介导的肿瘤细胞多药耐药的相关研究

摘要

研究背景：
　　几个世纪以来，科学家们一直在寻求治愈肿瘤的方法，随着对抗肿瘤作用机理研究的深入，抗肿瘤新药不断涌现。然而，在肿瘤的治疗中一个很大的障碍是肿瘤细胞的多药耐药，最终导致了肿瘤化疗的效果不佳甚至失败。ABC(ATP-binding cassette)跨膜转运蛋白超家族在肿瘤的耐药过程中起着很大的作用，影响着肿瘤细胞对不同药物的吸收、分布、代谢和排出。这些ABC跨膜转运蛋白超家族在肿瘤细胞常常高表达，与抗癌药物相结合，利用ATP水解释放能量促使药物被泵到胞外，从而导致肿瘤细胞产生耐药性。由于ABC跨膜转运蛋白超家族的这一特点，学者们开始致力于寻找能够有效抑制ABC跨膜转运蛋白家族的抑制剂。
　　近年来，一些酪氨酸激酶抑制剂如表皮生长因子受体抑制剂等被发现能够逆转ABC跨膜转运蛋白介导的多药耐药。Tivozanib(AV-951，KRN-951)是一种新型的酪氨酸激酶抑制剂，能够抑制血管内皮生长因子1、2、3。由于很多酪氨酸激酶抑制剂同时为ABCB1和ABCG2的逆转剂，本研究主要探索tivozanib与ABC跨膜转运蛋白之间的作用关系及其相关机制。
　　研究目的：
　　1.检测tivozanib的细胞毒性作用;
　　2.研究tivozanib是否能够逆转ABC跨膜转运蛋白介导的多药耐药;
　　3.探讨tivozanib逆转肿瘤细胞多药耐药的机制。
　　研究方法
　　1.实验中用到的细胞株包括人口腔上皮鳞癌细胞KB-3-1和用秋水仙碱诱导KB-3-1产生的耐药细胞株KB-C2;人胚肾HEK293细胞转染空载pcDNA3.1构建的HEK293/pcDNA3.1、转染ABCB1构建的HEK/ABCB1以及过表达ABCG2的转染细胞株ABCG2-482-R2、ABCG2-482-G2、ABCG2-482-T7。
　　2.MTT方法用于检测tivozanib在不同细胞株中的毒性，以及tivozanib对于耐药细胞株耐药倍数的影响。
　　3.Western Blotting用于检测细胞中ABCB1、ABCG2分子的表达，分析tivozanib对于ABC跨膜蛋白表达的影响。
　　4.Accumulation assay用于检测放射元素标记的ABCB1作用底物[3H]-paclitaxel和ABCG2作用底物[3H]-mitoxantrone在细胞内的积累情况。
　　5.Effiux assay用于检测细胞在不同时间点对于ABCB1作用底物[3H]-paclitaxel和ABCG2作用底物[3H]-mitoxantrone的外泵作用。
　　6.[125I] Iodoarylazidoprazosin(IAAP)-photoaffinity labeling探讨tivozanib与ABCB1和ABCG2的作用位点。
　　7.ATPase assay用于测定tivozanib对于ABCB1和ABCG2的ATP酶活性的影响。
　　研究结果：
　　1.Tivozanib在浓度小于6μM时对于实验中所涉及的细胞株无明显细胞毒性。
　　2.Tivozanib在2.5μM和5μM的浓度时能够逆转ABCB1和ABCG2介导的多药耐药。MTT结果显示tivozanib在特定浓度能够显著降低耐药细胞株对于ABCB1转运底物紫杉醇、秋水仙碱和长春新碱的耐药性，以及ABCG2过表达细胞株对于ABCG2转运底物底物米托葸醌、SN-38和多柔比星的耐药性。
　　3.Western blotting表明tivozanib抑制ABCB1、ABCG2的功能不是通过下调其蛋白表达来实现的。
　　4.Effiux assay和accumulation assay的结果证实tivozanib是通过抑制ABCB1和ABCG2转运蛋白的活性，进而增加细胞内化疗药物的积累来发挥逆转多药耐药的功能。
　　5.[125I]IAAP-photoaffinity labeling提示tivozanib能够与IAAP竞争与跨膜转运蛋白ABCB1、ABCG2的结合区域，说明tivozanib是通过直接结合于ABCB1、ABCG2转运蛋白的底物结合位点来发挥作用的。
　　6.ATPase试验表明tivozanib能够通过调节ABCB1和ABCG2结构域中ATP水解酶的活性，来抑制ABCB1和ABCG2介导的多药耐药。
　　结论：
　　1.Tivozanib在特定浓度能够逆转ABCB1、ABCG2跨膜转运蛋白介导的多药耐药。
　　2.Tivozanib逆转多药耐药的机制可能是通过直接与ABCB1、ABCG2蛋白的结构域相结合，调节ATP水解酶活性来实现的。

目录

声明

摘要

缩略语表

前言

第一部分 Tivozanib抑制ABCB1介导的多药耐药及其机制探讨

1．1 主要试剂和耗材

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂的配制

1．3．1 DMEM培基的配制

1．3．2 药物的配置

1．3．3 MTT应用液(4 mg／ml)

1．3．4 Western Blotting试剂配制

1．4 实验方法

1．4．1 细胞培养

1．4．2 MTT法

1．4．3 细胞中ABCB1蛋白表达量的检测

1．4．4 [3H]-paclitaxel accumulation assay

1．4．5 [3H]-paclitaxel efflux assay

1．4．6 [125I]IAAP-photoaffinity labeling

1．4．7 ABCB1转运蛋白ATPase活性检测

1．4．8 统计学分析

1．5 实验结果

1．5．1 Tivozanib对于人口腔鳞癌细胞株KB-3-1及其耐药细胞株KB-C2的毒性

1．5．2 Tivozanib对于HEK293／pcDNA3．1及HEK／ABCB1的毒性检测

1．5．3 Tivozanib对于KB-C2细胞株的耐药逆转试验

1．5．4 Tivozanib对于HEK／ABCB1细胞株的耐药逆转试验

1．5．5 KB-C2细胞中ABCB1表达的检测

1．5．6 HEK／ABCB1细胞中ABCB1表达的检测

1．5．7 [3H]-paclitaxel在HEK／ABCB1细胞中的accumulation assay

1．5．8 [3H]-paclitaxel在HEK／ABCB1细胞中的efflux assay

1．5．9 Tivozanib与[125I]IAAP竞争结合ABCB1的作用位点

1．5．10 Tivozanib对ABCB1的ATPase活性影响

1．6 讨论

1．7 结论

第二部分 Tivozanib抑制ABCG2介导的多药耐药及其机制研究

2．1 主要试剂和耗材

2．2 主要仪器

2．3 主要试剂的配制

2．3．1 RPMI1640培基的配制

2．3．2 药物的配置

2．4 实验方法

2．4．1 细胞培养

2．4．2 MTT法

2．4．3 细胞中ABCG2蛋白表达量的检测

2．4．4 [3H]-mitoxantrone accumulation assay

2．4．5 [3H]-mitoxantrone efflux assay

2．4．6 [125I]IAAP-photoaffinity labeling

2．4．7 ABCG2 ATPase活性检测

2．4．8 统计学分析

2．5 实验结果

2．5．1 Tivozanib对于HEK293／pcDNA3．1和ABCG2过表达细胞株的毒性

2．5．2 Tivozanib对于ABCG2过表达细胞株的逆转试验

2．5．3 Tivozanib对于ABCG2蛋白表达影响的检测

2．5．4 [3H]-mitoxantrone在ABCG2过表达细胞中的accumulation assay

2．5．5 [3H]-mitoxantrone在ABCG2过表达细胞株中的efflux assay

2．5．6 Tivozanib与[125I]IAAP竞争结合ABCG2的作用位点

2．5．7 Tivozanib对ABCG2的ATPase活性影响

2．6 讨论

2．7 结论

参考文献

综述 ABC跨膜转运蛋白的研究进展

攻读学位期间主要的研究成果

致谢