FGF-2和BMP-2诱导低密度人骨髓间充质干细胞(hMSCs)成骨分化的协调机制研究

摘要

牙周组织缺损、牙槽嵴裂骨缺损、口腔种植术中骨缺损、上下颌骨缺损都是口腔牙颌面部领域常见的骨组织缺损疾病类型，采用组织工程方法构建复合种子细胞、支架材料和生长因子的生物活性人工骨被认为是未来进行骨缺损修复和骨再造最有效的方法之一。种子细胞，作为组织工程技术的非常重要的三要素之一，对于骨再生修复至关重要。但是，目前传统的基于细胞迁移和细胞归巢的骨再生策略均面临着细胞来源不够这一技术难题。因为，在正常情况下，只有极少数的移植细胞或是在趋化作用下归巢的干/祖细胞能够迁移到骨损伤部位并存活下来。而在修复大面积骨缺损时，干/祖细胞的增殖却是分化成骨的必要前提。因此，想要得到有效的骨修复必须合理调控细胞增殖与分化这个“矛盾体”。多种生长因子参与调控干细胞的增殖与分化，合理应用多种生长因子能有效促进骨修复。然而在已有的研究中，绝大多数只考虑一种生长因子或几种生长因子简单混合对骨再生的影响，治疗效果不够理想。本研究主要在对比两种生长因子(FGF-2、BMP-2)的释放模式来实现对低密度细胞培养条件下的种子细胞的增殖与分化阶段进行调控，并找到最佳调控释放模式，以此提高骨修复效率。本研究证明了低密度人骨髓间充质干细胞(hMSCs)增殖先于hMSCs成骨分化的重要性，同时进行了多种生长因子的控制释放研究。本研究中对细胞增殖和成骨分化的操作方法不仅有助于理解两种生长因子的相互作用，更为临床应用提供了参考模式。内容分为以下三章:
　　第一章：FGF-2及BMP-2对人骨髓间充质干细胞生物学效应的实验研究
　　实验一：FGF-2及BMP-2对人骨髓间充质干细胞增殖效应的实验研究
　　目的:通过体外实验检测FGF-2和BMP-2单独、联合作用对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)增殖效应的效应。
　　方法:采用CyQUANT Cell Proliferation Assay检测法，检测不同浓度FGF-2和BMP-2单独、联合应用3天后hMSCs增殖的状况，并进行统计学分析。
　　结果:FGF-2能显著地均促进hMSCs的增殖，并呈剂量依赖性，当达到20ng/mL时促增殖能力最强，而之后加大浓度促增殖能力减弱。相反的，BMP-2呈现出阶段性的抑制增殖作用，低浓度(0.1-1.0ng/mL)时，BMP-2对细胞增殖的促进或抑制作用均不明显，高浓度（10-200 ng/mL）时能抑制细胞增殖，且抑制效果与剂量有关。
　　结论:不同生长因子的不同处理方式对hMSCs增殖的效应不同。联合使用FGF-2和BMP-2时，细胞增殖能力下降，BMP-2影响FGF-2促细胞增殖能力。
　　实验二：FGF-2及BMP-2对人骨髓间充质干细胞骨分化效应的实验研究
　　目的:检测FGF-2和BMP-2单独、联合作用对人hMSCs分化的效应。
　　方法:通过定量生化比色法测定不同样品BMP-2、FGF-2、FGF-2/BMP-2处理按6孔培养板最低细胞密度接种培养的细胞后的碱性磷酸酶(ALP)时间曲线以检测生长因子(GFs)对ALP活性的影响。应用分光光度法检测单独、联合施加BMP-2和FGF-2后，hMSCs细胞外基质钙含量水平以反映对细胞分化作用的影响，并进行统计学分析。
　　结果:BMP-2能在较长时间内明显提高细胞ALP活性水平及促进钙的沉积，而FGF-2则起到抑制作用。BMP-2单独作用成骨效应明显高于FGF-2或两种生长因子联合作用。
　　结论:不同生长因子的不同处理方式对hMSCs分化的效应不同。FGF-2和BMP-2联合应用会抑制BMP-2的促成骨分化能力。
　　第二章：体外制备FGF-2和BMP-2核壳微球实现序贯性释放FGF-2和BMP-2
　　实验一：FGF-2和BMP-2核壳双层结构微球的制备及性质鉴定
　　目的:制备FGF-2和BMP-2先后释放的核壳双层微球控释系统以及普通单层微球、同步释放核壳微球、FGF-2单因子核壳微球、BMP-2单因子核壳微球。并对不同组微球性质进行鉴定。
　　方法:利用同轴静电喷雾法，通过改变进入同轴针聚合乳化液的位置来改变因子在核壳结构微球中的位置分布以期达到改变因子释放速率的目的，同时通过改变针的类型制备不同结构微球。并采用多种方法对微球的形态学、包裹率、体外释放特性进行检测。
　　结果:各组微球形态规整，粒径均一，分散性好。香豆素染色表明有明显核壳结构，核壳结构显著提高了生长因子在核中的包封率。体外释放结果表明能实现先后释放不同生长因子并能调控释放模式的目的。
　　结论:同轴静电喷雾法制得的双因子先后释放的控释体系性质优良，可实现不同因子的控制释放。
　　实验二：FGF-2和BMP-2控释核壳结构微球对骨髓间充质干细胞骨向分化的影响
　　目的:通过比较不同结构微球释放模式作用hMSCs后对ALP活性影响以及钙含量的改变，确定BMP-2和FGF-2释放的最佳模式。
　　方法:将低密度细胞培养条件下的hMSCs细胞接种于培养皿中，加入不同组微球，观察不同释放模式微球对细胞ALP活性以及钙含量的影响。
　　结果:在所有实验组中，BMP-2（B组）和FGF-2（先）/BMP-2（后）（S2组）的效果最好。S2组的ALP强度是普通单层微球(U)和同步释放组（P组）的6倍（所有组别微球内FGF-2或/和BMP-2的总含量相同）。4周后测定不同组的钙含量。对照组（C组），空白组1、2(B1、B2)的钙含量很少，而普通单层组(U)、FGF-2单因子核壳微球组(F)、BMP-2单因子核壳微球组(B)、同步释放核壳微球组(P)、BMP-2（先）/FGF-2（后）核壳微球组(S1)和FGF-2（先）/BMP-2（后）核壳微球组(S2)中的钙含量较多，S2组钙含量比B组高(p＜0.05)。U、P和S1组的值是S2组的1/4。
　　结论:FGF-2和BMP-2同时释放或BMP-2先于FGF-2释放时，FGF-2会影响BMP-2的促成骨分化作用。因此，FGF-2和BMP-2的释放顺序应严格控制。
　　第三章：FGF-2和BMP-2控释核壳结构微球局部植入对SD大鼠骨再生的影响
　　目的:通过构建大面积骨缺损模型，评价双因子微球控释体系的成骨性能，以及组织工程骨所治疗大面积骨缺损的效果。
　　方法:将SD大鼠的胫骨行部分切除术，将切除部分过液氮处理后回植，在缺损周围植入第二部分实验中制备的普通单层核壳微球、同步释放微球或者两种不同顺序释放FGF-2和BMP-2的双层核壳微球，观察双层微球为载体缓释FGF-2和BMP-2诱导低密度hMSCs原位成骨的能力，X线通过影像学、组织切片HE染色进行评估。
　　结果: X线影像学、组织切片HE染色均显示FGF-2先释放BMP-2后释放(S2)组SD大鼠大面积骨缺损修复效果最佳。
　　结论:在SD大鼠骨缺损模型中使用先促细胞增殖再促骨分化的核壳结构微球后，骨缺损愈合率提高，骨缺损再生修复结果良好。

目录

声明

摘要

中英文对照及缩略写词汇表

前言

第一章 FGF-2及BMP-2对人骨髓间充质干细胞生物学效应的实验研究

实验一 FGF-2及BMP-2对人骨髓间充质干细胞增殖效应的实验研究

1．1．1 概述

1．1．2 材料与方法

1．1．3 结果

1．1．4 讨论

1．1．5 结论

实验二 FGF-2及BMP-2对人骨髓间充质干细胞骨分化效应的实验研究

1．2．1 概述

1．2．2 材料与方法

1．2．3 结果

1．2．4 讨论

1．2．5 结论

第二章 体外制备FGF-2和BMP-2核壳微球实现序贯性释放FGF-2和BMP-2

实验一 FGF-2和BMP-2控释核壳结构微球的制备及性质鉴定

2．1．1 概述

2．1．2 材料与方法

2．1．3 结果

2．1．4 讨论

2．1．5 结论

实验二 FGF-2和BMP-2控释核壳结构微球对人骨髓间充质干细胞骨向分化的影响

2．2．1 概述

2．2．2 材料与方法

2．2．3 结果

2．2．4 讨论

2．2．5 结论

第三章 FGF-2和BMP-2控释核壳结构微球局部植入对SD大鼠骨再生的影响

3．1 概述

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

全文总结

参考文献

综述

攻读学位期间主要的研究成果

致谢