冠心Ⅱ号主要吸收成分羟基红花黄色素A抗动脉粥样硬化的机理及相对贡献度研究

摘要

目的:
　　动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)是脂质代谢异常导致的动脉血管壁的慢性炎症性疾病，是冠心病、心肌梗死、高血压等心血管疾病共同的病理基础。冠心Ⅱ号由已故的著名中医学家郭士魁先生所创制，方含丹参、川芎、赤芍、红花和降香五味中药（比例2∶1∶1∶1∶1），是治疗冠心病的经验方。中医方剂的疗效作用是中药中多种化学成分共同作用的结果。本实验目的:①运用超高效液相色谱(UPLC)法测定冠心Ⅱ号中有效成分的含量，定量分析阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素、芍药苷和原儿茶醛5种成分;②建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法定量定性分析C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ号血浆中3种主要吸收成分阿魏酸、羟基红花黄色素A和丹参素;③选用ApoE-/-小鼠并给予高脂饮食饲养建立动脉粥样硬化模型，从氧化应激机制角度，研究冠心Ⅱ号主要吸收成分羟基红花黄色素A抗动脉粥样硬化的机理及相对贡献度。
　　方法:
　　①超高效液相色谱(UPLC)法测定冠心Ⅱ号中阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素、芍药苷和原儿茶醛5种有效成分的含量。色谱条件:流动相:甲醇(A)和1％乙酸水(B);梯度洗脱;0min97％B;1min97％B;6min85％B;11min80％B;15min55％B。
　　②超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法对C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ号血浆主要吸收成分的定性定量分析。色谱条件:流动相:甲醇(A)-0.1％甲酸(B);梯度洗脱:0min90％B;5min40％B;6min10％B;7min10％B;8min90％B。质谱条件:离子源:ESI(电喷雾电离，electrospray ionization);检测方式:正离子模式;扫描方式:MRM(多反应监测，multiple-reaetion monitoring);定量分析时的离子反应分别为m/z192.8-m/z133.96(阿魏酸)、m/z611-m/z491.04(羟基红花黄色素A)和m/z196.8-m/z178.96(丹参素)。
　　③选定主要吸收成分羟基红花黄色素A，与母方冠心Ⅱ号对ApoE-/-小鼠抗动脉粥样硬化的疗效进行比较并明确机理，运用公式(相对贡献度=成分疗效÷母方疗效×100％)，初步定量主要吸收成分羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号抗动脉粥样硬化的相对贡献度。在本课题研究中，以As模型组为参照，成分疗效是指与As模型组比较，给予羟基红花黄色素A干预后，各种药效指标含量或表达水平上升或下降的变化差值;母方疗效是指与As模型组比较，给予冠心Ⅱ号干预后，各种药效指标含量或表达水平上升或下降的变化差值，二者变化差值的比值即为羟基红花黄色素A的相对贡献度。选用ApoE-/-小鼠给予高脂饮食喂养8周建立动脉粥样硬化模型，行血脂[甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]水平检测、主动脉弓HE染色和油红O染色以及血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)含量测定;Real Time Q-PCR检测胸腹主动脉肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)、白介素-1β(IL-1β) mRNA水平;Western Blot检测胸腹主动脉TNF-α、VCAM-1、IL-1β表达。
　　结果:
　　①UPLC法测定冠心Ⅱ号汤剂中阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素、原儿茶醛和芍药苷5种有效成分的含量。15min内5种成分良好分离，色谱峰单一且无杂峰干扰。线性回归、精确度、准确度、回收率、重现性和样本稳定性均良好。5种有效成分含量分别为:阿魏酸128.84±0.47(ng/mg·生药)、羟基红花黄色素 A1949.61±1.56(ng/mg·生药)、丹参素270.38±1.95(ng/mg·生药)、原儿茶醛184.84±0.80(ng/mg·生药)、芍药苷389.67±0.91(ng/mg·生药)。
　　②UPLC-MS/MS法对C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ号血浆3种主要吸收成分的定量定性分析，结果提示阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素均可在血浆中检测到，含量分别为:20.4ng/ml、154.0ng/ml和6.9ng/ml，其中羟基红花黄色素A含量最高。
　　③选用ApoE-/-小鼠予以高脂饮食饲养建立动脉粥样硬化模型，结果提示:a）.血清血脂水平检测:与正常对照组相比，模型组TC、HDL-C、LDL-C水平增高，但TG没有差异。冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A干预后TC、HDL-C、LDL-C水平下降，其中羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号降低血脂TC、HDL-C、LDL-C水平的相对贡献度分别为:46.42％、64.09％、53.89％; b).HE染色镜下可见动脉粥样斑块形成，油红O染色可见脂质及斑块呈红色。斑块面积分析，模型组为(43.25±3.70)％，冠心Ⅱ号组为(30.20±1.48)％，羟基红花黄色素A组为(35.63±2.06)％。羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号减少斑块面积的相对贡献度为58.39％;c）.血清MDA、SOD、GSH、CAT含量测定:与正常对照组相比，模型组MDA含量增加，SOD、GSH、CAT水平下降;冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A干预后MDA含量减少;SOD、GSH、CAT水平升高。羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号降低MDA含量和升高CAT、SOD、GSH水平的相对贡献度分别为:55.79％、56.00％、32.61％、28.34％; d).Real Time Q-PCR检测胸腹主动脉TNF-α、VCAM-1和IL-1β mRNA水平:与正常对照组相比，模型组TNF-α、VCAM-1和IL-1β mRNA表达水平升高;冠心Ⅱ号和羟基;花黄色素A干预后TNF-α、VCAM-1和IL-1βmRNA表达水平下降;羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号降低TNF-α、VCAM-1和IL-1β mRNA表达水平的相对贡献度分别为:81.83％、85.96％和82.67％;e).Western Blot检测胸腹主动脉TNF-α、VCAM-1和IL-1β表达:与正常对照组相比，模型组TNF-α、VCAM-1和IL-1β表达升高;冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A干预后TNF-α、VCAM-1和IL-1β表达下降;羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号降低TNF-α、VCAM-1和IL-1β表达的相对贡献度分别为:58.88％、61.83％和52.17％。
　　结论:
　　①运用超高效液相色谱(UPLC)方法对冠心Ⅱ号汤剂中阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素、芍药苷和原儿茶醛5种有效成分的含量测定，该方法快速灵敏、准确可靠、稳定且重复性好。
　　②采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法定性定量分析C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ号血浆中3种主要吸收成分为阿魏酸、羟基红花黄色素A和丹参素，其中羟基红花黄色素A含量最高。为研究羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号抗动脉粥样硬化的机理及相对贡献度奠定了基础。
　　③ApoE-/-小鼠经过高脂饮食喂养8周后，形成了典型的冠状动脉粥样硬化病变。冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A灌胃后，可以改善As病变小鼠血脂水平及斑块进展程度。
　　④As病变小鼠机体氧化应激状态增强，冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A具有降低氧化应激水平从而减轻As病变程度的作用。
　　⑤主要吸收成分羟基红花黄色素A和母方冠心Ⅱ号通过抗氧化应激发挥抗As作用，比较二者疗效，可认为羟基红花黄色素A在冠心Ⅱ号抗As过程中发挥了一定的相对贡献度。

目录

声明

论文说明

摘要

缩写词简表

前言

第一章 超高效液相色谱(UPLC)法测定冠心Ⅱ号中有效成分含量

引言

1 材料和方法

1．1 材料和仪器

1．2 方法

2 结果

2．1 冠心Ⅱ号汤剂色谱图及光谱图

2．2 标准曲线

2．3 精密度测定

2．4 加样回收率试验

2．5 稳定性测定

2．6 重复性测定

2．7 样品含量测定

3 讨论

4 结论

第二章 超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS／MS)法对C57BL／6J小鼠灌胃冠心Ⅱ号血浆主要吸收成分的定性定量分析

引言

1 材料和方法

1．1 材料和仪器

1．2 方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三章 主要吸收成分羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号抗动脉粥样硬化的机理及相对贡献度研究

引言

1 材料和方法

1．1 材科和仪器

1．2 方法

1．3 统计学分析

2 结果

2．1 小鼠血清血脂(TG、TC、HDL-C和LDL-C)水平测定

2．2 小鼠主动脉弓HE染色和油红O染色

2．3 小鼠血清氧化应激指标(MDA、SOD、GSH、CAT)含量检测

2．4 Real Time Q-PCR测定小鼠胸腹主动脉TNF-α、VACM-1、IL-1β mRNA水平

2．5 Western Blot测定各组小鼠胸腹主动脉TNF-α、VCAM-1、IL-1β表达

3 讨论

3．1 中医对动脉粥样硬化的认识

3．2 冠心Ⅱ号与羟基红花黄色素A

3．3 冠心Ⅱ号及其吸收成分羟基红花黄色素A对冠状动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠的血清胆固醇影响

3．4 冠心Ⅱ号及其吸收成分羟基红花黄色素A对ApoE-/-小鼠冠状动脉粥样硬化形成的影响

3．5 冠心Ⅱ号及其吸收成分羟基红花黄色素A对冠状动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠氧化应激分子MDA、SOD、GSH和CAT的影响

3．6 冠心Ⅱ号及其吸收成分羟基红花黄色素A对冠状动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠胸腹主动脉TNF-α、VCAM-1、IL-1β的影响

4 结论

第四章 全文总结

参考文献

综述一 动脉粥样硬化血脂异常：心血管疾病的危险因素及其饮食干预

综述二 动脉粥样硬化心血管疾病诊断与预防的进展

攻读学位期间主要的研究成果及参与的科研项目

致谢