餐后富含甘油三酯脂蛋白中的载脂蛋白E在成脂分化中的作用

摘要

背景：
　　近年来，肥胖的发病率逐渐升高。作为糖尿病、冠心病、中风、癌症等多种疾病的独立危险因素，肥胖已成为日趋严重的公共卫生问题。肥胖是白色脂肪细胞肥大、增生和白色脂肪组织增多的结果。高甘油三酯血症患者血中增多的富含甘油三酯脂蛋白(TRLs)与肥胖密切相关。TRLs不仅参与脂肪细胞肥大，而且促进脂肪细胞增生。极低密度脂蛋白（VLDL）及残粒脂蛋白可诱导各种前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，且VLDL诱导的成脂分化依赖于脂蛋白表面的载脂蛋白E(ApoE)，但潜在的机制尚不清楚。ApoE可与多种脂蛋白受体结合，作为配体参与细胞受体介导的脂蛋白内吞过程。在肝细胞中，低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)均可识别脂蛋白中的ApoE，介导细胞对TRLs的摄取及降解。成脂分化中脂肪细胞表面也表达这些受体。故推测:TRLs中的ApoE在成脂分化中的重要作用可能涉及到ApoE依赖性的脂蛋白内吞作用。
　　目的：
　　(1)观察TRLs中的ApoE对3T3-L1前体脂肪细胞成脂分化的影响;
　　(2)探讨成脂分化中的脂肪细胞是否依赖于ApoE内吞TRLs;
　　(3)明确分化中的脂肪细胞内吞TRLs颗粒的受体途径。
　　方法：
　　收集人与小鼠高脂餐后4小时的血浆，利用密度梯度分离法获得富含甘油三酯的脂蛋白(TRLs)，将获得的TRLs干预3T3-L1前体脂肪细胞，分别进行以下实验:
　　(1)在有或无胰岛素（10ug/mL）的辅助下，分别以不同质量浓度的人TRLs(h-TRL s)(25、50、100、150mg/L)孵育细胞14天，以及用100mg/L h-TRLs与10ug/mL胰岛素孵育细胞0、4、7、10、14天，通过油红O染色检测脂滴，实时荧光定量PCR及Western Blot检测脂肪细胞标志物—脂肪酸结合蛋白(aP2)、核调控因子—过氧化物酶体增殖活化受体γ(PPAR-γ)及CCAAT增强结合蛋白(CEBPs)的表达，旨在观察人TRLs的促成脂分化作用;
　　(2)在胰岛素(10ug/mL)的辅助下，分别用100mg/L的野生型小鼠的餐后TRLs或ApoE基因敲除小鼠的餐后TRLs孵育细胞14天，通过油红O染色检测脂滴，观察餐后TRLs表面的ApoE在成脂分化中的作用;
　　(3)用能发出红色荧光的Atto565 NHS标记各种TRLs，通过激光共聚焦显微镜观察餐后TRLs被分化中的脂肪细胞内吞的情况，以明确TRLs中的ApoE在细胞内吞TRLs中的作用;
　　(4)通过实时荧光定量PCR及Western Blot检测成脂分化过程中ApoE相关脂蛋白内吞受体的表达;
　　(5)利用受体相关蛋白（RAP）或肝素分别干扰TRLs与LDLR家族成员或HSPG的结合，通过激光共聚焦显微镜观察细胞内吞TRLs的情况，以探讨分化中的脂肪细胞内吞餐后TRLs的受体途径。
　　结果：
　　1、人的餐后TRLs在胰岛素（10ug/mL）的辅助作用下可成功诱导3T3-L1前体脂肪细胞分化为脂肪细胞:在胰岛素的辅助下，细胞内的脂滴含量与TRLs质量浓度呈正相关(r=0.971，P＜0.01)。实时荧光定量PCR提示aP2及PPAR-γ的mRNA水平随TRLs质量浓度的增加而表达上调(P＜0.05）;Western Blot发现:aP2或PPAR-γ的蛋白含量不仅与TRLs质量浓度呈正相关(aP2:r1=0.993，P1＜0.01; PPAR-γ:r1=0.900，P1＜0.05);而且与100mg/L TRLs处理时间呈正相关(aP2:r2=0.964,P2＜0.01; PPAR-γ:r2=0.975,P2＜0.01)。
　　2、在胰岛素（10ug/mL）的辅助下，野生型小鼠TRLs处理组细胞内有明显的脂滴，ApoE基因敲除小鼠TRLs处理组细胞内脂滴形成明显减少。
　　3、激光共聚焦显微镜证实:人和野生型小鼠TRLs处理组细胞内均可见明显的红色荧光标记的TRLs颗粒，ApoE基因敲除小鼠TRLs处理组细胞内红色荧光标记的TRLs颗粒显著减少。
　　4、在人TRLs诱导的成脂分化中:
　　(1)不同浓度TRLs处理组低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)基因水平低于胰岛素对照组，但LRP1蛋白水平随TRLs质量浓度增大有增多的趋势。
　　(2)与未分化的3T3-L1细胞相比，在100mg/L TRLs处理组的各个阶段，LRP1蛋白水平无明显变化，但持续存在较高的表达水平。
　　5、与对照组相比，肝素处理组细胞内红色荧光标记的TRLs颗粒无明显变化，RAP处理组细胞内红色荧光标记的TRLs颗粒明显减少。
　　结论：
　　1、餐后TRLs呈浓度及时间依赖性诱导成脂分化，并伴随aP2、 PPAR-γ表达的上调。
　　2、餐后TRLs促成脂分化能力及其被分化中脂肪细胞内吞的过程均依赖于TRLs表面的ApoE。
　　3、LDLR家族成员—LRP1可能是介导分化中的脂肪细胞内吞餐后TRLs的重要受体。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语

第一章 前言

第二章 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

第三章 结果

3．1 3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞

3．2 h-TRLs对成脂分化的影响

3．3 TRLs中的ApoE对成脂分化的影响

3．4 脂蛋白中的ApoE在TRLs的内吞中的作用

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 脂肪细胞合成的载脂蛋白E和脂蛋白上的载脂蛋白E调控脂肪细胞中甘油三酯含量

致谢