MUC1靶向脂质—聚合物杂化纳米粒的构建及体外评价

摘要

一、研究背景及目的：
　　主动靶向制剂是抗肿瘤药物新剂型研究的主要方向，脂质-聚合物杂化纳米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticle)是一类基于脂质体和聚合物纳米粒发展的新型载药系统，在肿瘤靶向给药方面优势独特。MUC1蛋白是大多数肿瘤细胞表面异常表达的糖蛋白，是一种广谱肿瘤靶标分子。本课题以核酸适配体(Aptamer，Apt) S2.2作为靶向配体，难溶性抗肿瘤化合物长春瑞滨(Vinorelbine，VRL)作为模型药物，采用自组装法构建载药脂质．聚合物杂化纳米粒(Apt-NP/VRL)用于表达MUC1蛋白的肿瘤细胞靶向递药。通过制备不同S2.2密度的Apt-NP/VRL，研究表面S2.2密度对纳米粒制剂特性及靶向作用的影响。
　　二、方法与结果：
　　1.靶向脂质．聚合物杂化纳米粒的制备和表征
　　以VRL作为模型药物，大豆卵磷脂、DSPE-PEG2000-COOH和聚乳酸羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)为载体材料，采用自组装法构建载药脂质-聚合物杂化纳米粒（NP/VRL）。首先评价处方中影响制剂学特性的关键因素，再以正交设计优化NP/VRL处方。利用3'末端氨基修饰的核酸适配体S2.2(Apt)与DSPE-PEG2000-COOH键合生成DSPE-PEG2000-Apt。在优化处方的基础上，固定DSPE用量，通过调节DSPE-PEG2000-Apt与DSPE-PEG2000-COOH的比例制备不同适配体密度的纳米粒（Apt-NP/VRL）并对其进行表征。
　　正交设计优化的处方为脂质占PLGA的15％，DSPE-PEG2000-COOH占脂质的60％，药载比15∶100，PLGA浓度为8mg·mL-1，水相有机相体积比为1∶2。本文共制备了6种Apt密度的纳米粒，根据DSPE-PEG2000-Apt占DSPE总量的摩尔比例分别记作Apt0-NP/VRL、Apt0.5-NP/VRL、Apt1-NP/VRL、Apt2-NP/VRL、Apt5-NP/VRL、Apt10-NP/VRL。X射线光电子能谱证明Apt成功键合在纳米粒表面。透射电镜观察Apt-NP/VRL形态呈规则的球形，表面光滑圆整。Apt密度对纳米粒的粒径、粒径分布、zeta电位等制剂特性无影响。Apt-NP/VRL的粒径为128.1～166.5 nm，zeta电位为-23.7～-31.6 mV，包封率为50.42～57.88％。纳米粒在PBS(pH7.4)溶液中132 h累积释药小于50％，具有缓释性。
　　2.靶向脂质-聚合物杂化纳米粒的细胞摄取研究
　　采用流式细胞术筛选人乳腺癌细胞MCF-7作为MUC1阳性细胞，人肝癌细胞HepG2作为MUC1阴性细胞。以荧光染料香豆素-6(Cou-6)为探针研究摄取行为。采用荧光显微镜定性观察Apt10-NP/Cou-6和Apt0-NP/Cou-6对细胞的选择性。采用酶标仪测定细胞的荧光强度，定量考察不同Apt密度纳米粒的细胞摄取率，评价纳米粒的靶向性并研究适配体密度对选择性摄取的影响。
　　结果表明，Apt-NP/Cou-6的粒径分布、zeta电位等与Apt-NP/VRL一致，且Cou-6在PBS(pH7.4)溶液中24 h内累积泄漏量小于5％，说明Apt-NP/Cou-6可示踪纳米粒的体内或细胞跨膜转运行为。荧光显微镜显示纳米粒可在1 h内进入细胞质，MCF-7细胞对Apt10-NP/Cou-6的摄取率高于Apt0-NP/Cou-6，说明Apt-NP/Cou-6与MUC1蛋白的特异性结合有利于纳米粒的摄取。未表达MUC1蛋白的HepG2细胞对Apt10-NP/Cou-6的摄取低于Apt0-NP/Cou-6，可能与Apt增加纳米粒负电性有关。MCF-7细胞和纳米粒共同孵育1h后，与Apt0-NP/Cou-6相比， Apt0.5-NP/Cou-6、Apt1-NP/Cou-6、Apt2-NP/Cou-6、Apt5-NP/Cou-6、Apt10-NP/Cou-6的细胞摄取率由（11.6±1.2）％分别增至（15.7±1.4）％、（16.8±0.7）％、(18.8±2.3)％、（23.9±3.8）％、（24.6±4.6）％。说明增加纳米粒表面S2.2的修饰密度，纳米粒的靶向性增强。
　　3.靶向脂质-聚合物杂化纳米粒的体外抗肿瘤活性研究
　　采用MTT法测定细胞活性，考察Apt-NP/VRL的细胞毒性，评价Apt-NP/VRL的体外抗肿瘤活性。结果表明，Apt-NP/VRL对MUC1阳性细胞的活性抑制高于对照细胞，Apt0.5-NP/VRL、Apt1-NP/VRL、Apt2-NP/VRL、Apt5-NP/VRL、Apt10-NP/VRL对MCF-7细胞的抑制率分别是HepG2细胞的1.3、1.5、1.6、1.5、1.7倍。提示Apt-NP/VRL可以特异性地识别并杀伤MUC1阳性细胞。
　　分别制备一系列VRL浓度的Apt-NP/VRL溶液，与MCF-7细胞共同孵育24 h，测定Apt-NP/VRL的IC50值，研究适配体密度对靶向抗肿瘤活性的影响。结果表明，随着S2.2的修饰密度增加，纳米粒的细胞毒性逐渐增强(p＜0.05）。与非靶向纳米粒Apt0-NP/VRL相比，靶向纳米粒Apt0.5-NP/VRL、Apt1-NP/VRL、Apt2-NP/VRL、Apt5-NP/VRL、Apt10-NP/VRL的IC50值由（21.3±0.2）μg·mL-1分别减小至（19.2±0.1）、（15.4±0.2）、（10.3±0.2）、（8.7±1.0）、（7.2±0.4）μg· mL-1。
　　三、结论：
　　以脂质．聚合物杂化纳米粒为载体包载VRL，表面修饰靶向MUC1蛋白的核酸适配体S2.2可构建主动靶向递药系统(Apt-NP/VRL)。Apt密度对纳米粒的粒径、粒径分布、zeta电位等无影响。Apt-NP/VRL体外释药具有缓释性，可特异性地结合MUC1阳性细胞。随着S2.2密度的增加，Apt-NP/VRL的细胞摄取增加，对阳性细胞的杀伤性增强。Apt-NP/VRL可实现MUC1阳性肿瘤细胞靶向递药。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

前言

第一章 靶向脂质-聚合物杂化纳米粒的制备和表征

1 仪器与试剂

1．1 仪器

1．2 试剂

2 方法与结果

2．1 VRL含量测定方法的建立

2．2 NP／VRL的制备

2．3 Apt-NP／VRL的制备

3 讨论

3．1 Apt-NP／VRL的制备工艺

3．2 DSPE-PEG2000-Apt的表征

3．3 Apt-NP／VRL的结构

4 小结

第二章 靶向脂质-聚合物杂化纳米粒的细胞摄取研究

1 仪器与试剂

1．1 仪器

1．2 试剂

2 方法与结果

2．1 细胞培养

2．2 细胞表面MUC1蛋白表达的检测

2．3 Apt-NP／Cou-6的制备与表征

2．4 细胞摄取Apt-NP／Cou-6的定性考察

2．5 细胞摄取Apt-NP／Cou-6的定量考察

3 讨论

3．1 细胞表面MUC1蛋白的检测

3．2 Cou-6示踪纳米粒的可行性分析

3．3 S2．2的靶向介导作用

4 小结

第三章 靶向脂质-聚合物杂化纳米粒体外抗肿瘤活性研究

1 仪器与试剂

1．1 仪器

1．2 试剂

2 方法与结果

2．1 细胞培养

2．2 Apt-NP／VRL的体外抗肿瘤活性研究

2．3 适配体密度对靶向性的影响

3 讨论

3．1 MUC1作为肿瘤递药的靶标

3．2 Apt-NP／VRL的靶向抗肿瘤活性

4 小结

全文总结

参考文献

综述 脂质-聚合物杂化纳米粒肿瘤递药的研究进展

攻读学位期间主要研究成果

致谢