可溶性环氧化物水解酶抑制剂经微小RNA-1调节PI3K通路机制的研究

摘要

目的:
　　1.研究可溶性环氧化物水解酶抑制剂(soluble epoxide hydrolaseinhibitor sEHi)t-AUCB(trans-4-[4-(3-adamantan-1-yl-ureido)-cyclohexyloxy]-bensoic acid)干预对原代乳小鼠心肌细胞心肌缺血模型中内向整流型钾电流(IK1)幅度的影响。
　　2.探讨t-AUCB调控微小RNA-1（microRNA-1 miR-1）机制，明确miR-1参与PI3K通路的调控。
　　方法:
　　体外部分:
　　选取出生1天的昆明小鼠乳鼠，培养原代心肌细胞，分5组进行不同的干预:(1)空白对照组(Ctl);(2) micrONTM mmu-miR-1a-3pagomir(agomiR-1)转染组(agomiR-1);(3)agomiR-1转染+t-AUCB干预组（agomiR-1+t-AUCB）;(4) micrONTM mmu-miR-1a-3p agomirnegative control组(Neg Ctl);(5)agomiR-1转染+DMSO干预组(agomiR-1+DMSO)。最后以全细胞模式记录钾电流(IK1)。
　　体内部分:
　　1.8周雄性昆明小鼠分成5组:(1)饮用水+假手术组(饮用水+sham);(2)饮用水+心肌梗死组（饮用水+MI）;(3) t-AUCB0.2mg/L+心肌梗死组(t-AUCB0.2mg/L+MI);(4) t-AUCB1mg/L+心肌梗死组(t-AUCB1 mg/L+MI);(5)t-AUCB5mg/L+心肌梗死组(t-AUCB5mg/L+MI)。24小时后取出心梗后缺血区心肌，运用Western Blot检测缺血区心肌p-AKT、p-GSK3β的表达。
　　2.8周雄性昆明小鼠，用含t-AUCB5mg/L饮用水喂养7天，建立心梗模型后以尾静脉注射转染agomiR-1或阴性对照物agomiR-1Neg Ctl，具体分组如下:(1)饮用水+假手术组（饮用水+sham）;(2)饮用水+心肌梗死组（饮用水+MI）;(3)饮用水+心肌梗死组+agomiR-1组（饮用水+MI+agomiR-1）;(4)饮用水+心肌梗死+agomiR-1 Neg Ctl组（饮用水+MI+ Neg Ctl）;(5) t-AUCB5mg/L+心肌梗死组(t-AUCB5mg/L+MI);(6) t-AUCB5mg/L+心肌梗死+agomiR-1组(t-AUCB5mg/L+MI+ agomiR-1)。24小时后取出心梗后缺血区心肌，运用Western Blot检测缺血区心肌p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达。
　　3.8周雄性昆明小鼠，用含t-AUCB5mg/L饮用水喂养7天，建立心梗模型后以尾静脉注射或腹腔注射PI3K抑制剂wortmannin，具体分组如下:(1)饮用水+假手术组（饮用水+sham）;(2)饮用水+心肌梗死组（饮用水+MI）;(3) t-AUCB5mg/L+心肌梗死组(t-AUCB5mg/L+MI);(4) t-AUCB5mg/L+心肌梗死+wortmannin0.3mg/kg（尾静脉注射）(t-AUCB5mg/L+MI+0.3W[尾]）;(5) t-AUCB5mg/L+心肌梗死+wortmannin0.3mg/kg（腹腔注射）(t-AUCB5mg/L+MI+0.3W[腹腔]）。24小时后取出心梗后缺血区心肌，运用Real-time PCR检测缺血心肌KCNJ2，GJA1 mRNA的变化。
　　结果
　　体外部分:
　　1.所测电流的I-V曲线随着电压增加，其电流偏向于X轴，符合内向整流型钾电流的特点。
　　2.在-100mV，正常对照组的IKI电流密度为-4.62±0.24pA/pV。
　　3.使用miR-1激动剂agomiR-1200nM转染心肌细胞以模拟心肌缺血状态，在-100mV时，IK1电流密度为-0.05±0.06 pA/pV，与正常对照组相比明显减小，差异具有显著性(n=6，p＜0.05)。
　　4.使用miR-1激动剂agomiR-1转染心肌细胞48小时后再使用10μM的t-AUCB干预心肌细胞，在-100mV时，IK1电流大小为-2.71±0.12 pA/pV，与miR-1过表达组相比，IK1电流密度显著增大，表示药物干预具有统计学意义(n=6，p＜0.05)。
　　5.使用agomiR-1 NC干预组，在-100mV时，IK1电流大小为-3.94±0.27 pA/pV，与正常对照组相比无统计学差异(n=6，p＞0.05)。
　　6.使用miR-1激动剂agomir miR-1200nM转染心肌细胞48小时后再使用DMSO干预组，在-100mV时，IK1电流密度为-0.16±0.04pA/pV，与miR-1过表达组相比无统计学差异(n=6，p＞0.05)。
　　体内部分:
　　1.饮用水+MI组的p-AKT、p-GSK3β表达水平较饮用水+sham组明显降低，差异具有统计学意义(n=6，p＜0.05)。
　　2.t-AUCB能够浓度依赖性地增加心梗后缺血心肌中p-AKT、p-GSK3β表达水平，差异有统计学意义(n=6，p＜0.05)。
　　3.尾静脉注射miRNA-1激动剂agomiR-1后p-AKT、p-GSK3β水平进一步下降，5mg/L t-AUCB能够拮抗agomir miRNA-1的上述作用，差异有统计学意义(n=6，p＜0.05)。
　　4.t-AUCB5mg/L干预后能使小鼠心脏缺血区心肌组织KCNJ2、GJA1 mRNA的表达量明显增加，差异有统计学意义(n=6，p＜0.05)。尾静脉注射或腹腔注射PI3K抑制剂wortmannin能拮抗t-AUCB处理使小鼠心脏缺血区组织的KCNJ2、GJA1 mRNA表达增加的影响(n=6，all p＜0.05)。
　　结论
　　体外部分:
　　1.miR-1过表达时IK1电流密度明显减小。
　　2.t-AUCB能逆转miR-1过表达所致的IK1电流密度的改变。
　　结合前期证实: t-AUCB通过调控miR-1作用于靶基因KCNJ2而引起IK1电流的改变。
　　体内部分:
　　1.心肌梗死后小鼠缺血区心肌组织的p-AKT，p-GSK3β表达下降。
　　2.t-AUCB能够浓度依赖性地上调缺血区心肌组织的p-AKT，p-GSK3β表达。
　　3.miR-1过表达试剂agomiR-1通过尾静脉注射能使小鼠心脏缺血区组织的p-AKT，p-GSK3β表达进一步下降，而t-AUCB能够拮抗miR-1过表达所引起的上述改变。
　　4.t-AUCB5mg/L干预后能使小鼠心脏缺血区KCNJ2、GJA1mRNA的表达量明显增加，而使用PI3K抑制剂wortmannin尾静脉注射或腹腔注射后能拮抗t-AUCB所致上述mRNA表达的改变。
　　结合前期证实:t-AUCB经miR-1调控PI3K/AKT通路发挥抗缺血性心律失常作用。

目录

声明

摘要

主要中英文缩略语词表

前言

第一部分 体外部分

第一章 材料与方法

1 实验动物

2 仪器设备与试剂

3 可溶性环氧化物水解酶抑制剂(t-AUCB)保存液的配制

4 原代乳小鼠心肌细胞培养

5 实验分组

6 膜片钳全细胞记录具体步骤

7 统计与分析

第二章 结果

1 原代乳小鼠心肌细胞形态学

2 AgomiR-1转染后模拟心肌缺血情况下，t-AUCB对原代乳小鼠心肌细胞IK1电流密度的影响

第三章 讨论

第四章 结论

第二部分 体内部分

第一章 材料与方法

1 实验动物

2 仪器设备与试剂

3 可溶性环氧化物水解酶抑制剂(t-AUCB)原液的配制

4 T-AUCB对心梗后小鼠缺血区心肌组织中p-AKT、p-GSK3 β的影响

5 小鼠心肌梗死模型的建立

6 尾静脉注射mmu-miR-1a-3p agomir转染小鼠及实验分组

7 PI3K抑制剂wortmannin干预实验分组

8 标本取材

9 免疫印迹法(Western Blot)检测

10 实时荧光定量多聚链式反应(Real time PCR)

11 统计与分析

第二章 结果

1 不同浓度t-AUCB(0．2、1、5mg／L)对小鼠心梗后缺血区心肌组织p-AKT蛋白表达的影响

2 不同浓度t-AUCB(0．2、1、5mg／L)对小鼠心梗后缺血区心肌组织p-GSK3β蛋白表达的影响

3 AgomiR-1转染后t-AUCB对小鼠心梗后缺血区心肌组织p-AKT蛋白表达的影响

4 agomiR-1转染后t-AUCB对小鼠心梗后缺血区心脏组织p-GSK3β蛋白表达的影响

5 PI3K抑制剂wortmannin对t-AUCB干预后小鼠心梗后缺血区心肌KCNJ2 mRNA表达的影响

6 PI3K抑制剂wortmannin对t-AUCB干预小鼠心梗后缺血区心肌GJA1 mRNA表达的影响

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述 内向整流钾电流与心律失常

致谢