胚胎干细胞诱导分化过程中组织因子表达及调控的初步研究

摘要

研究背景：
　　近年来基因与蛋白的特异性表达已成为发育生物学中的研究热点。目前已发现多种基因及蛋白活化及其失活在生理发育及疾病发展过程中起着十分重要的调控作用。组织因子(Tissue factor, TF)是由263个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，其在生理及病理情况下的活化及特异性表达对于维持机体凝血平衡和保护重要脏器方面具有不可替代的作用。同时，TF在造血细胞中亦呈现明显的表达差异，其具体调控机制目前尚未明确。表观遗传学作为生物遗传学的重要分支，近年来亦成为生命科学的关注重点。目前认为基因的表观遗传学调控对于基因和蛋白表达以及生物体各类细胞的发育分化起到关键性的作用。同时，人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）也由于其自身的多向分化潜能和维持自我更新的特性，成为再生医学领域中模拟组织器官发育及探讨生理病理机制的重要实验材料。
　　在这些研究的基础上，我们在本实验中成功建立了胚胎干细胞特异性诱导分化为造血干细胞及滋养层细胞的培养体系，检测了不同分化阶段以及不同类型细胞中TF的表达变化，并进一步探讨了TF在不同细胞种类及各分化阶段的表达是否与其接受表观遗传学调控有关。基于以上目的，本研究分为以下三个章节:
　　第一章 hESCs向造血干细胞及滋养层细胞诱导分化体系的建立
　　目的：建立一个可行的人胚胎干细胞诱导分化平台，摸索出有效地造血干细胞及滋养层细胞的分化体系，为后续实验提供可靠的细胞标本。
　　方法：1.使用胚胎干细胞(hESCs)与小鼠骨髓基质细胞(OP9)共培养方法，诱导分化出HSC细胞，通过RT-PCR及流式细胞学检测细胞特异性标记。
　　2.采用免疫磁珠法分选出CD34+细胞，在体外应用不同细胞因子组合分别诱导CD34+细胞向粒系、红系及巨核系分化，用RT-PCR、流式细胞学检测诱导分化效率。
　　3.使用Marixgel+BMP4方法诱导分化出滋养层细胞，通过RT-PCR及免疫荧光法检测细胞特异性标记。
　　结果：1.使用胚胎干细胞(hESCs)与小鼠骨髓基质细胞(OP9)共培养方法，在培养第0天、第5天可见干细胞多能相关基因OCT-4及NANOG表达，造血分化相关基因SCL无表达;培养第9天OCT-4及NANOG无表达，SCL高表达，且流式细胞学检测CD34+细胞比例达到13.89％。
　　2.采用免疫磁珠法分选出CD34+细胞，添加不同细胞因子组合分别诱导14天，流式细胞学检测粒系细胞比例达到93.05％，红系细胞比例达到83.33％，巨核系细胞比例达到68.42％。
　　3.使用Marixgel+BMP4方法诱导分化出滋养层细胞，培养第0天可见OCT-4表达;培养第5天可见滋养层特异性基因CDX2表达，免疫荧光检测示滋养层特异性标记TROMA-1表达。
　　结论：我们建立了有效的人胚胎干细胞向造血细胞及滋养层细胞的诱导分化体系，为后续实验提供了前提条件。
　　第二章人胚胎干细胞诱导发育过程中组织因子的表达变化
　　目的：测定人胚胎干细胞定向发育为造血干细胞、各系血细胞及滋养层细胞过程中组织因子的表达变化。
　　方法：1.使用RT-PCR方法检测人胚胎干细胞定向发育过程中TF基因的表达变化。
　　2.使用流式细胞学方法检测TF特异性抗原的表达变化。
　　3.使用TF活性检测TF基因的表达变化。
　　4.使用Western blot检测TF蛋白水平的变化。
　　结果：1.在人胚胎干细胞向造血干细胞定向分化过程中，RT-PCR、流式细胞学及TF活性检测均未检测出TF基因表达。
　　2.使用RT-PCR方法，粒系CD15+细胞及巨核系CD41+细胞可检测出TF基因mRNA表达，红系CD235a+细胞未检测出TF基因表达。
　　3.采用流式细胞学检测，粒系细胞、巨核系细胞及红系细胞的TF表达率分别为5.83％、3.94％和1.58％。3.TF活性检测，CD15+细胞可检测到微弱TF活性，其余细胞无明显TF活性表达。
　　4.人胚胎干细胞向滋养层细胞分化过程中可检测出TF的mRNA、蛋白水平及活性表达。
　　结论：1.在人胚胎干细胞向造血干细胞发育过程中，无TF及其活性表达。
　　2.在造血干细胞向各系血细胞发育过程中，诱导形成的粒系细胞在mRNA及蛋白水平均表达TF，TF活性微弱表达;巨核系细胞在mRNA水平表达TF基因，但基本无蛋白及活性表达;红系细胞在mRNA及蛋白水平均无TF表达，亦几乎无活性表达。
　　3.在人胚胎干细胞向滋养层细胞分化过程中，诱导形成的滋养层细胞在mRNA及蛋白水平均有TF基因表达，TF活性高表达。
　　第三章 hESCs诱导分化过程中TF表观遗传调控的初步研究
　　目的：测定人胚胎干细胞定向发育为造血干细胞、各系血细胞及滋养层细胞过程中TF基因DNA启动子区甲基化程度及其变化。
　　方法：使用特异性甲基化PCR(MSP-PCR)方法检测人胚胎干细胞定向发育过程中TF基因的DNA启动子区甲基化程度及其变化。
　　结果：1.在人胚胎干细胞向造血干细胞定向分化过程中，TF基因的DNA启动子区呈现半甲基化半非甲基化表达，并且以甲基化表达为主。
　　2.在造血干细胞定向分化过程中，粒系细胞甲基化程度较前减少，其余各系甲基化及非甲基化程度无明显改变。
　　3.在人胚胎干细胞向滋养层细胞分化过程中，TF基因的DNA启动子去呈现半甲基化半非甲基化表达，并随着滋养层细胞的形成甲基化程度下降，非甲基化程度增加。
　　结论：在人胚胎干细胞中TF基因的DNA启动子区呈现半甲基化半非甲基化表达，并随着细胞分化及TF表达增高出现甲基化水平下降，非甲基化水平增加趋势，表明DNA甲基化对于TF基因表达有一定调控作用。

目录

声明

论文说明

摘要

符号及中英文缩写对照名词表

前言

实验技术路线图

第一章 hESCs向造血干细胞及滋养层细胞诱导分化体系的建立

1．1 材料和方法

1．2 统计学分析

1．3 实验结果

1．4 讨论

1．5 结论

第二章 人胚胎干细胞诱导发育过程中TF的表达变化

2．1 材料和方法

2．2 统计学分析

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 hESCs诱导分化过程中TF表观遗传调控的初步研究

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

小结

参考文献

综述 组织因子表达及调控的研究进展

致谢

攻读学位期间的主要研究成果