马铃薯淀粉水解液碳源两步法促培小球藻油脂富集及机制研究

摘要

生物柴油（biodiesel）是由油脂或脂肪酸与甲醇通过酯交换反应而生成的脂肪酸甲酯。小球藻（Cholorella protothecoides）在异养发酵培养条件下细胞内可积累含量较高油脂和脂肪酸，是一种能持续生产生物柴油的潜力原料。而异养发酵底物葡萄糖占据培养成本的80％，限制了其应用。为降低小球藻培养成本和增加小球藻油脂积累量，本文通过马铃薯淀粉水解液替代葡萄糖作为碳源对小球藻进行异养发酵培养，并对化能异养-贫氮两步法油脂积累及其代谢调控机制进行探讨研究。主要内容和结果如下：
　　1.葡萄糖碳源对小球藻生物量和油脂积累的影响
　　以葡萄糖为碳源时小球藻最佳生长条件的碳氮组合配比是葡萄糖浓度为40g/L，尿素浓度为3g/L，此时小球藻生物量为15.59g/L,脂肪酸产率最大为1.26g/L,总脂含量最高为6.407g/L。
　　2.马铃薯淀粉水解液中还原糖浓度对小球藻生长的影响
　　利用α-淀粉酶和葡萄糖糖化酶双酶协同酶解马铃薯淀粉，最佳工艺条件为：反应温度80℃、底物质量浓度0.1 g/L、加酶量为0.6％、反应时间4 h、反应pH4.0，在此条件下，水解液中葡萄糖含量可达802.9 g/L。马铃薯淀粉水解液中葡萄糖浓度为40g/L时，小球藻各生物指标都达到最优结果，即小球藻生物量、总脂产量和脂肪酸产率分别为20.23g/L，8.6g/L，1.66g/L。与精制葡萄糖相比作碳源相比，生物量增加了22.94%，总脂产量增加了25.5%，脂肪酸产率增加了24.1%。
　　3.异养-贫营养两步法对小球藻生物量和油脂积累的影响
　　以马铃薯淀粉水解液为碳源，尿素为氮源两步法培养小球藻。在马铃薯淀粉水解液碳源浓度为40g/l，尿素为3g/L条件下生长168h，转至尿素浓度为0,0.15,0.30,0.45,0.60 g/L缺氮培养基中培养72h。结果显示，小球藻生物量在不同缺氮条件下都有所增长，而尿素缺失培养基中，小球藻生物量略有降低，细胞内油脂含量高达72%。
　　4.异养-贫营养两步培养条件下小球藻油脂积累机理探讨
　　以一步法培养藻细胞为对照组，异养-贫营养两步培养小球藻细胞为实验组，进行蛋白质组学分析。通过2D-PAGE双向电泳建立了2组样品重复性较好的电泳图谱，运用Image Scanner光学扫描仪，采用ImageMaster2D platinum5.0分析，确定差异表达2.5倍以上的蛋白质点或者新诱导、消失的有意义蛋白点50个；利用MASCOT程序实施NCBInr蛋白数据库检索，确认了33个蛋白质点身份，包括15种表达下调蛋白和18种表达上调蛋白。KEGG代谢通路分析表明，在缺氮藻细胞中，下调蛋白主要参与光合作用、蛋白质生物合成与折叠、基因调控和油脂代谢。7种参与光合作用（L29，L31，L32，L34，L39，L46，L67）的光捕捉叶绿素结合蛋白质表达下调，暗含细胞的光合作用和电子传递链受到抑制；4种（L41，L76，L78，L79）参与蛋白质合成和折叠的酶表达下调，细胞生长受到抑制；参与脂肪酸β-氧化的酰基辅酶A脱氢酶（L70）明显下调，证实脂肪酸分解受阻，促进脂肪酸的合成；在上调蛋白质当中，7种（H7，H12，H26，H30，H31，H40，H47）参与碳水化合物的代谢，证明缺氮促进了糖酵解途径的活跃，碳流流向脂肪酸合成方向；4种应激反应和防御蛋白（H10，H11，H19和 H38）表达上调，证实细胞在营养限制条件下的自我保护。总之，在氮缺失条件下，脂肪酸β-氧化的抑制和糖酵解途径促进了油脂合成。

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第1章 绪论

1.1 生物柴油基本性质

1.2 生物柴油的生产原料

1.3 微藻生物柴油的生产

1.4 小球藻概述

1.5 马铃薯淀粉作为小球藻生长的有机碳源

1.6 微藻生物柴油规模化最终依赖于微藻细胞的产油效率

1.7 发展“两段培养模式”概述

1.8 微藻胞内油脂合成积累代谢途径及机制概述

1.9 本课题研究内容

第2章 葡萄糖碳源对小球藻生长和油脂积累的影响

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章马铃薯淀粉水解液作碳源对小球藻生长和油脂积累的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第4章 两种碳源培养小球藻比较

4.1 引言

4.2 实验材料和方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第5章 两步法促培小球藻油脂积累机理探讨

5.1 引言

5.2 实验材料和方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

结论与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及研究成果