脂肪酶催化合成(S)-吲哚洛芬及其与小分子相互作用机理

摘要

2-芳基丙酸(2-arylpropanoic acid，2-APA)类手性药物是一类重要的消炎、镇痛、抗风湿药物，其α-C为手性碳原子，(S)-对映体具有较强消炎镇痛作用，(R)-对映体活性低或无活性。吲哚洛芬是此类药物的典型代表之一，手性拆分外消旋吲哚洛芬合成(S)-吲哚洛芬具有重要现实意义。微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase,CRL)是其重要品种之一，具有较高酶活性和稳定性，可催化酯水解、酯交换、酯合成等反应，在油脂加工、食品、医药等工业领域具有广阔应用前景和较高商业价值。特别是在手性化合物酶促不对称合成中具有不可替代的作用。本论文以脂肪酶催化酯对映体选择性水解合成(S)-吲哚洛芬为主线，分子对接虚拟筛选脂肪酶底物、优化脂肪酶对映体选择性水解反应条件、探讨小分子乙醛和金属离子与脂肪酶分子相互作用机理以及对脂肪酶对映体选择性的调控，在此基础上探讨有机相脂肪酶催化对映体选择性水解拆分反应动力学模型，为脂肪酶工业应用提供依据和技术支撑。
　　基于生物大分子与小分子配体识别与作用规律，本文利用分子对接软件AutoDock4.2.5预测11种2-2-APA类底物在CRL活性口袋中的结合模式，可视化解析CRL2-2-APA乙酯复合物空间构象和2-APA乙酯与CRL氨基酸残基的结合位点；根据自由结合能打分和分簇聚类结果，筛选出用于后续试验的最佳底物，为脂肪酶家族的催化机理提供理论依据。CRL催化拆分2-APA乙酯合成(S)-2-APA结果和分子对接理论研究结果基本一致，两者相互补充，从实验和理论两方面协同研究了2-APA配体底物与CRL间的相互作用。筛选出吲哚洛芬乙酯为CRL催化2-APA乙酯手性合成(S)-2-APA的最佳底物。分子对接虚拟筛选CRL最佳拆分底物的研究少有报道。
　　研究了非水介质中吲哚洛芬乙烯酯酶促不对称水解合成(S)-吲哚洛芬。单因素实验考察吲哚洛芬酯结构、有机溶剂、底物浓度、酶浓度、反应时间、温度、pH、吐温-80浓度、含水量等各种因素对酶促水解拆分反应的影响；在此基础上，响应面法研究了酶浓度、反应时间、温度、pH对该反应的影响，优化得到最佳工艺参数并经模型验证，确定CRL拆分吲哚洛芬乙烯酯合成(S)-吲哚洛芬的最佳反应条件为：含水量0.16％、1.2%吐温-80、异辛烷-甲苯(90/10)混合体系中，加入5g/L吲哚洛芬乙烯酯，175.00mg/L CRL，充分混匀后于pH7.5，38.5 oC，150rpm反应39h，反应转化率c和e.e.p值分别可达47.51%和98.57%，对应E值为421.27，比优化前提高了11.91%。跟模型预测值相比，相对误差为1.17%(小于5%)，表明模型拟合度好，可用于CRL催化拆分IVE合成(S)-吲哚洛芬的预测。
　　乙醛是CRL水解拆分吲哚洛芬乙烯酯反应副产物。乙醛对CRL水解活性表现出低促高抑的Hormesis现象，其最大激活浓度为0.2215mmol/L。红外、紫外、荧光光谱结合动力学研究表明：0.2215mmol/L乙醛处理后CRL的-螺旋和β-折叠含量增加，无规则卷曲和分子内β-折叠聚集含量减少，CRL二级结构趋向有序化，其活性中心微环境疏水性降低。分子对接预测CRL分子与乙醛相互作用发现，乙醛分子进入CRL活性口袋，通过氢键与其活性中心内部的Ser209、Ser389、Trp188、Gly124、Gly342结合，并诱导了CRL分子内部Gln338与Glu341间氢键的形成，导致CRL二级结构发生扭曲变化。在此基础上，研究发现开放系统中残留的微量乙醛对CRL对映体选择性几乎无影响。
　　不同类型金属离子对CRL催化特性的影响各异。碱土金属离子(Mg2+、Ca2+、Sr2+和Ba2+)对CRL催化活性呈现出相同的变化趋势，并表现出类似“Hormesis”效应的低促高抑现象。过渡金属(Cu2+、Zn2+)呈现出低浓度轻微促进高浓度严重抑制的规律；Mn2+对则均表现为抑制作用。其中，0.01mol/L Mg2+显著提高该CRL催化反应的对映体选择性。光谱学方法研究表明，0.01mol/L Mg2+可使CRL在保持基础二级结构的基础上，-螺旋和β-折叠含量小幅增加，其结构趋向于柔性变化，增加了底物与酶活性中心接触机会，导致酶活性增加。邹氏酶活性不可逆改变底物反应动力学模型拟合结果表明0.01mol/L Mg2+对CRL为非竞争性不可逆激活，而1mol/L Mg2+对CRL为非竞争性不可逆抑制。
　　提出非水相中CRL催化水解拆分吲哚洛芬乙烯酯反应符合存在底物和产物抑制的不可逆Ping-Pong Bi-Bi反应机制。在理想状态CRL酶促水解拆分反应动力学模型基础上，推导脂肪酶催化拆分2-芳基丙酸酯水解反应速率方程，并进一步简化修正为符合CRL催化不可逆水解拆分吲哚洛芬乙烯酯反应相应的简化动力学模型。通过参数拟合确定简化模型最佳参数，拟合结果表明该模型可用于描述有机溶剂体系CRL催化水解吲哚洛芬乙烯酯合成(S)-吲哚洛芬反应过程。

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第一章 引 言

1.1 研究目的与意义

1.2 2-芳基丙酸类抗炎药

1.3 脂肪酶

1.4 基于脂肪酶分子对接

1.5 脂肪酶手性拆分2-芳基丙酸类药物

1.6 金属离子与脂肪酶

1.7 本论文研究思路

第二章 分子对接虚拟筛选脂肪酶作用底物

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第三章 脂肪酶水解拆分合成(S)-吲哚洛芬

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 小结

第四章 乙醛对脂肪酶三维结构的影响及其作用机理

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.1 主要实验仪器及参数表

4.3 结果与讨论

4.4 结论

第五章 金属离子调控脂肪酶活性及其作用机理

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3结果与讨论

5.4 结论

第六章 脂肪酶催化拆分吲哚洛芬乙烯酯动力学

6.1引言

6.2 材料与方法

6.3 脂肪酶酶促水解反应动力学

6.4 结果与讨论

6.5 小结

结论与展望

参考文献

致谢

攻读博士期间取得的主要成果