梅毒螺旋体外膜蛋白核酸疫苗的筛选构建及其免疫效果的比较研究

摘要

目的：筛选比较梅毒螺旋体(Treponemapallidum，Tp)各外膜蛋白的抗原性和同源性，分别构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和双基因融合表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92，检测其所诱导产生的体液免疫和细胞免疫应答水平，比较单基因核酸疫苗和双基因融合核酸疫苗的免疫效果，为研制高效、新型的Tp核酸疫苗提供实验依据。　　方法：用PCGENE软件分析Tp外膜蛋白Gpd和Tp92基因序列，设计相应特异性引物，PCR分别扩增上述两基因1059bp和2103bp的目的基因片段，将其插入pUCm-T载体，通过蓝白斑初筛，酶切分析、PCR及测序鉴定筛选阳性重组体；将Gpd和Tp92基因亚克隆至真核表达载体构建pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92重组体，并分别转染HeLa细胞，用免疫细胞化学及westernblot鉴定其在真核细胞的表达；分别在0、2、4、8w将核酸疫苗pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92、pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92及对照空质粒pcDNA3.1(+)分组注射于新西兰兔后腿股四头肌，每次剂量为100μg，末次免疫后2w，无菌分离兔脾细胞，经特异性重组蛋白抗原刺激后，ELISA双抗体夹心法测定培养上清中IFN-γ水平，ELISA间接法测定新西兰兔血清中抗Gpd和抗Tp92特异性抗体水平；MTT法、淋巴细胞转化试验测定脾淋巴细胞特异性增殖反应。　　结果：成功构建了pcDNA3.1(+)-Gpd和pcDNA3.1(+)-Tp92单基因真核表达载体及pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92融合基因真核表达载体，三重组质粒均能在HeLa细胞内有效表达靶蛋白。新西兰兔接种Gpd或Tp92单基因核酸疫苗后均能产生特异性抗体，6w后经ELISA测定抗体最高滴度均达1：1024，两组抗体A450值(0.82：0.78)无显著性差异(P＞0.05)。新西兰兔接种Gpd-Tp92融合基因核酸疫苗后，能产生特异性抗体，6w后抗体ELISA最高滴度达1：1024，A450值(0.86)与两单基因疫苗组A450值(0.82、0.76)均无显著性差异(P＞0.05)。Gpd、Tp92单基因核酸疫苗组和Gpd-Tp92融合基因核酸疫苗组的兔脾淋巴细胞经相应特异性抗原刺激后，培养上清中IFN-γ均显著升高(分别升至476±38.624pg/mL、483±38.884pg/mL、543±41.625pg/mL)，与空质粒组兔脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平(87±13.635pg/mL)之间有显著性差异(P＜0.01)；实验组淋巴细胞转化率(49.5％、52.8％、58.5％)均高于对照组(24.6％)。Gpd、Tp92单基因核酸疫苗组和Gpd-Tp92融合基因核酸疫苗组兔脾淋巴细胞经相应特异性抗原刺激后其刺激指数分别为(2.58±0.46、2.34±0.43、3.17±0.52)，均明显高于对照组(1.57±0.28)(P＜0.05)。　　结论：(1)TpGpd和Tp92单基因核酸疫苗及TpGpd-Tp92融合基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答。(2)TpGpd和Tp92单基因核酸疫苗及TpGpd-Tp92融合基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强的体液免疫应答。(3)双基因核酸疫苗诱生特异性抗体的效率与单基因核酸疫苗无明显差异；但其能诱导更强，更持久的细胞免疫应答。

目录

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常用英文缩写

1引言

2实验材料

3实验方法

第一部分 Tp真核表达重组体的构建及鉴定

1.1真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-Gpd的构建及鉴定

1.2真核表达重组pcDNA3.1(+)-Tp92的构建及鉴定

1.3真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92的构建及鉴定

第二部分 真核表达重组体在Hela细胞中的表达

第三部分 Gpd、Tp2单基因核酸疫苗和Gpd-Tp92融合核酸疫苗免疫活性的比较研究

4实验结果

第一部分 Tp真核表达载体的构建及鉴定

第二部分 真核表达载体在Hela细胞中的表达

2.1 pcDNA3.1(+)-Gpd在Hela细胞中的表达

2.2重组质粒pcDNA3.1(+)-Tp92在Hela细胞中的表达鉴定

2.3 pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92在Hela细胞中的表达鉴定

第三部分 Gpd、Tp2单基因核酸疫苗和Gpd-Tp92融合核酸疫苗在新西兰中免疫活性的比较研究成果

5讨论

6结论

参考文献

附录

(一)上海生工Gpd基因测序图谱

(二)Gpd基因核苷酸序列的同源性比较

(三)Gpd基因片段序列及对应氨基酸编码序列

(四)Tp92基因测序图谱

(五)Tp92基因测序结果核苷酸同源性比较

(六)Tp92基因片段序列及对应的氨基酸编码序列

梅毒螺旋体外膜蛋白疫苗候选抗原基因的筛选研究现状

研究成果及发表论文

致谢