肥大细胞抑制HDL介导THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的研究

摘要

目的肥大细胞是一种参与炎症免疫应答反应的细胞。长期以来人们对肥大细胞的研究都侧重于过敏、皮炎、哮喘、关节炎等炎性及免疫性疾病。随着近年来人们对动脉粥样硬化的认识不断深入，从单纯的脂质学说到炎症学说，发现肥大细胞与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。本研究以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象，以药用水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂为干预试剂，研究肥大细胞(肥大细胞颗粒释放液)对高密度脂蛋白3介导其胆固醇流出的影响，并初步探讨其作用机制。 方法用Compound48/80处理大鼠腹腔肥大细胞后，采用荧光分光光度仪检测组胺释放率，甲苯胺蓝染色观察肥大细胞脱颗粒状态。LDTI的提取采用丙酮抽提，反相高效液相纯化。酶法检测MCs颗粒释放液中类胰蛋白酶的活性。THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞在有或无HDL3、肥大细胞颗粒释放液、LDTI的培养基里共育20h，油红O染色检测泡沫细胞内脂质，高效液相色谱检测细胞内胆固醇和CE，液体闪烁计数器、荧光分光光度仪检测细胞内胆固醇的流出；RT-PCR检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1mRNA的转录水平。15％非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳检测MCs颗粒释放液处理后的HDL3。 结果肥大细胞被Compound48/80处理后，甲苯胺蓝染色显示肥大细胞明显脱颗粒，组胺释放率为81.53±4.51％，表明肥大细胞脱颗粒度达到80％以上。肥大细胞颗粒释放液被LDTI处理后，类胰蛋白酶的活性显著被抑制，呈剂量依赖关1系，以LDTI达5μg/ml处理肥大细胞颗粒释放液时，类胰蛋白酶活性被抑制50％以上。THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞在有或无HDL3、肥大细胞颗粒释放液的培养基里共育后，结果显示，肥大细胞使胆固醇流出率明显减少，比对照组减少大约14％；使细胞内TC、FC蓄积增多，FC绝对量及FC/TC比值增加，CE以及CE/TC比值降低。用LDTI抑制肥大细胞颗粒释放液中类胰蛋白酶活性后，细胞胆固醇流出率相应增多，比抑制前增多大约1.6倍；细胞内TC、FC均下降，CE增加、CE/TC比值增大，表明MCs类胰蛋白酶可减少胆固醇流出，促使细胞内TC、FC蓄积。MCs颗粒释放液处理后的HDL3及载脂蛋白A-Ⅰ被降解。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，大约有28％的apoA-Ⅰ被降解，在分子量26KDa处左右出现了新的条带，产生了一个26KDa的小多肽。MCs对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的mRNA水平无直接影响，但能抑制HDL3下调ABCA1的mRNA水平，这可能由于MCs降解HDL3，抑制胆固醇流出，使胆固醇在细胞内蓄积增多的原因。 结论(1)肥大细胞能抑制HDL3介导的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出，促使细胞内胆固醇蓄积；　　(2)肥大细胞能降解HDL3的apoA-Ⅰ；　　(3)肥大细胞有抑制HDL3下调ABCA1mRNA水平的作用；　　(4)肥大细胞的上述作用与其类胰蛋白酶相关。

目录

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引言

1材料与方法

2实验结果

2.1LDL的氧化修饰及鉴定

2.2Compound 48/80对大鼠腹腔MCs脱颗粒的影响

2.3THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型建立

2.4LDTI的HPLC分析

2.5LDTI抑制类胰蛋白酶的量效曲线

2.6MCs对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇的影响　

2.7MCs对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响

2.8MCs对HDL3的降解

2.9MCs对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCAlmRNA水平的影响

3讨论

结论

参考文献

附录:主要英文缩略语索引

综述:肥大细胞在动脉粥样硬化斑块形成和破裂中的意义

成果目录

致谢