蛋白激酶C活性变化对adipophilin介导脂质蓄积的影响

摘要

胆固醇等中性脂质的蓄积是动脉粥样硬化泡沫细胞形成和四期病变发生的核心环节。在真核细胞中,这些蓄积的脂质主要以脂滴的形式贮存于胞浆中。Adipophilin就是脂滴外周40余种相关蛋白中含量最高的一种。其功能主要是促进细胞中脂质的蓄积,抑制胆固醇的外流。在adipophilin基因启动子区有过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR各亚型的反应元件PPRE,能够与PPARγ1、PPARγ2结合并调控人adipophilin基因的表达。而参与多种脂质代谢靶基因调控的核转录因子PPARs可以和转录共激活物PBP作用,直接接受信号转导关键酶PKC的磷酸化调控。研究adipophilin在脂质蓄积中的调控因素尤其是具有良好药物开发价值的PKC信号转导通路,有可能为动脉粥样硬化性疾病的防治带来新的契机。本研究首先在动脉粥样硬化新西兰白兔模型上观察Adipophilin和PKCα的表达;然后在细胞水平上观察oxLDL对A10大鼠主动脉平滑肌细胞、THP-1人巨噬细胞和ECV304人脐静脉内皮细胞PKC活性和PPARγ与Adipophilin表达的影响;进一步应用PKC激动剂PMA和抑制剂CalphostinC观察PKC活性的改变对荷脂THP-1巨噬细胞中PKCα、PPARγ和Adipophilin表达的影响,并检测细胞内脂质蓄积的改变情况,以初步探讨信号转导途径中的关键酶PKC调控adipophilin及脂质蓄积的可能机制。
　　第一部分动脉粥样硬化新西兰白兔Adipophilin和PKCα表达的变化
　　目的：在动脉粥样硬化新西兰白兔动物模型上,观察Adipophilin和PKCα表达的变化。
　　方法：采用本课题组建立的新西兰兔动脉粥样硬化动物模型。24只新西兰白兔,随机分为对照组和实验组。用高胆固醇饮食饲喂新西兰白兔12w,动脉切片HE染色;采用Westernblot蛋白印迹和免疫组化染色检测Adipophilin和PKCα表达。
　　结果：喂养12周后颈总动脉放血处死动物,实验组新西兰白兔病变主动脉区可见内膜增生、中膜增厚,脂质条纹突起,增生内膜内蓄积有大量的泡沫细胞。实验组主动脉病变区adipophilin和PKCα表达上调,与adipophilin阳性颗粒仅局限于增生内膜不同,PKCα在内膜、近内膜的中膜区均呈强阳性表达。
　　结论：动脉粥样硬化新西兰白兔主动脉明显增厚,病变区 Adipophilin, PKCα表达上调。
　　第二部分 OxLDL对A10、THP-1及ECV304三种细胞PKC活性和巨噬细胞PPARγ与Adipophilin表达的影响
　　目的：以A10、THP-1及ECV304三种细胞为研究对象,观察氧化型低密度脂蛋白对三种细胞PKC活性和PPARγ与Adipophilin表达的影响。
　　方法：用0,10,20,40,80μg/ml oxLDL共孵育24h,PepTag?非放射性蛋白激酶检测法对荷脂细胞胞膜中 PKC活性进行定性定量检测---琼脂糖凝胶电泳分离磷酸化条带,观察活性变化的趋势,紫外/可见分光光度计检测570nm吸光度,定量酶的绝对活性;半定量RT-PCR和Westernblot检测adipophilin、PPARγ和α亚型PKC表达的变化情况;油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况。
　　结果：随着 oxLDL浓度的增加,A10细胞膜 PKC活性从静息状态的0.2613±0.0521units/ml陡增至0.7685±0.0869units/ml;THP-1巨噬细胞由0.0670±0.0091units/ml增至0.1357±0.0235units/ml;ECV304内皮细胞由0.0550±0.0075units/ml增至0.1216±0.0187units/ml,其中平滑肌细胞膜活性增幅最大。RT-PCR和Westernblot检测显示平滑肌细胞和内皮细胞不表达adipophilin;随着氧化低密度脂蛋白浓度的增加,THP-1巨噬细胞adipophilin、PPARγ和α亚型PKC表达明显增强。油红O染色显示细胞内脂滴增加,部分融合成大脂滴。
　　结论：oxLDL浓度依赖性的增强平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞的蛋白激酶 PKC活性;adipophilin只表达于THP-1巨噬细胞;oxLDL明显的上调PKCα、PPARγ和Adipophilin的表达,其中,oxLDL对PKCα的作用最显著;oxLDL可以促进THP-1巨噬细胞中脂滴的蓄积。
　　第三部分蛋白激酶C在adipophilin促THP-1巨噬细胞脂质蓄积中的作用研究
　　目的：以THP-1巨噬细胞为研究对象,观察PKC激动剂PMA和抑制剂Calphostin C对胞膜PKC活性、胞膜PKCα及胞浆内PPARγ和adipophilin表达以及细胞内脂质蓄积的影响,初步探讨PKC调控adipophilin表达和脂质蓄积的作用机制。
　　方法：实验分两个部分:第一部分分组,10μl DMSO溶媒对照组;50μg/ml oxLDL+10μl DMSO组;50μg/ml oxLDL+100nmol/l PMA组;50μg/ml oxLDL+300nmol/lCalphostin C组,各组均在含2g/L BSA无血清培养基中与THP-1巨噬细胞共孵育16h;第二部分分组,50μg/ml oxLDL+10μl DMSO组;50μg/ml oxLDL+25nmol/lCalphostin C组;50μg/ml oxLDL+50nmol/lCalphostin C组;50μg/mloxLDL+100nmol/lCalphostinC组;50μg/ml oxLDL+200 nmol/l CalphostinC组;50μg/ml oxLDL+400nmol/lCalphostin C组均在含2g/L BSA无血清培养基中与 THP-1巨噬细胞共孵育细胞16h。检测方法及指标同第二部分。
　　结果：100nmol/l PMA在激活胞膜 PKC(0.2514±0.0154units/ml)的同时可以与oxLDL协同增强PKCα、PPARγ和Adipophilin表达并使细胞内脂滴的蓄积极大的增强,细胞内胆固醇酯/总胆固醇比值增至69.8±9.5％;300nmol/lCalphostin C对荷脂THP-1巨噬细胞的处理则抑制酶活性至0.0927±0.0056units/ml,细胞内脂滴减少,胆固醇酯/总胆固醇比值降至40.1±9.1%;Calphostin C呈剂量依赖性的方式下调酶活性、PKCα、PPARγ和Adipophilin表达,400nmol/lCalphostin C基本上可以逆转50μg/ml oxLDL诱导的酶活化和PKCα、PPARγ和Adipophilin表达的上调。
　　结论：佛波酯PMA增加荷脂THP-1巨噬细胞的蛋白激酶C活性,与oxLDL协同增强adipophilin、PPARγ和PKCα的表达,并进一步促进脂滴的蓄积和提升胆固醇酯/总胆固醇比值;抑制剂Calphostin C降低荷脂巨噬细胞胞膜PKC活性,减少细胞内脂质的蓄积,并呈剂量依赖性的下调Adipophilin、PPARγ和PKCα的表达。
　　总结：①动脉粥样硬化新西兰白兔主动脉病变区Adipophilin, PKCα表达上调。
　　②oxLDL浓度依赖性的增强平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞的蛋白激酶PKC活性;adipophilin只表达于THP-1巨噬细胞;oxLDL明显的上调PKCα、PPARγ和Adipophilin的表达,其中,oxLDL对PKCα的作用最显著;oxLDL可以促进THP-1巨噬细胞中脂质蓄积。
　　③佛波酯PMA增加荷脂THP-1巨噬细胞的蛋白激酶C活性,与oxLDL协同增强adipophilin、PPARγ和PKCα的表达,并进一步促进脂质蓄积和提升胆固醇酯/总胆固醇比值;抑制剂Calphostin C则可降低之。

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前言

第一部分动脉粥样硬化新西兰白兔Adipophilin和PKCα表达的变化

1．实验材料

2．实验方法

3 结果

4小结

第二部分 OxLDL对A10、THP-1及ECV304三种细胞PKC活性和巨噬细胞PPARγ与Adipophilin表达的影响

1 材料与方法

2 结果

3 小结

第三部分 蛋白激酶C在Adipophilin促THP-1巨噬细胞脂质蓄积中的作用研究

1 材料与方法

2 结果

3 小结

讨论

参考文献

英文缩略语索引

文 献 综 述

硕士期间发表的论文

致谢