Compound 48/80对ApoE-/-小鼠主动脉斑块的影响及肥大细胞对平滑肌细胞迁移作用的研究

摘要

目的:
　　肥大细胞(mast cells,MCs)是一种参与炎症及免疫应答反应的细胞。近年来随着对动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)认识的不断深入,发现MCs与AS发生发展的各个阶段都密切相关。AS斑块的细胞成分包括一些炎症细胞(T淋巴细胞,巨噬细胞,MCs等)和从血管中膜迁移到内膜的平滑肌细胞,但是关于 MCs与平滑肌细胞的关系并不明确,本实验以ApoE-/-小鼠为研究对象,复制AS模型,以Compound48/80和富马酸酮替芬作为处理因素,研究Compound48/80和富马酸酮替芬对ApoE-/-小鼠AS斑块的影响;同时以大鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)为研究对象,以 MCs作为处理因素,研究MCs对VSMCs迁移的作用,并初步探讨其作用机制。
　　方法:
　　30只8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为3组:对照组,Compound48/80组和富马酸酮替芬组。对照组给予普通饲料饲养24周;Compound48/80组给予0.15mg/kg Compound48/80,每周两次腹腔注射,普通饲料饲养24周;富马酸酮替芬组:0.1ml/只,每天灌胃一次,普通饲料饲养24周。实验结束后处死动物,摘眼球取血,分离血清,采用酶法测定血清脂质含量,苏丹Ⅳ大体染色,小鼠原位灌流固定,取胸主动脉置10％中性缓冲福尔马林溶液中固定,石蜡包埋,连续切片,HE染色;采用改良贴块法培养大鼠VSMCs,α-smooth muscle actin鉴定大鼠VSMCs,Compound48/80处理大鼠腹腔MCs后,采用荧光分光光度仪检测组胺释放率,甲苯胺蓝染色观察 MCs脱颗粒情况,用 DMEM、DMEM+Compound48/80、MCs、MCs+Compound48/80、Compound48/80刺激的MCs颗粒释放液、Compound48/80刺激的MCs残余物、无Compound48/80刺激的MCs颗粒释放液和无Compound48/80刺激的MCs残余物与同步化的VSMCs相互作用,Transwell渗透支持系统观察MCs对VSMCs迁移的影响, FITC标记的鬼笔环肽观察VSMCs微丝结构的改变。
　　结果:
　　1.Compound48/80组,富马酸酮替芬组和对照组之间的各项血脂含量无明显差异(P>0.05);苏丹Ⅳ大体染色结果显示:三组胸腹主动脉均有斑块形成,但Compound48/80组AS病变最为严重;HE染色结果显示:对照组,富马酸酮替芬组和Compound48/80组胸主动脉斑块面积和最大狭窄程度分别为0.51±0.16mm2、0.72±0.15 mm2、1.06±0.18mm2和14±4%、24±7%,34±10%;富马酸酮替芬组和Compound48/80组的胸主动脉斑块面积和最大狭窄程度与对照组相比,P<0.05;Compound48/80组的胸主动脉斑块面积和最大狭窄程度与富马酸酮替芬组相比,P<0.05。
　　2.Transwell渗透支持系统观察MCs对VSMCs迁移的影响,结果显示:
　　(1)MCs促进VSMCs发生迁移:MCs组,无Compound48/80作用MCs颗粒释放液组和无Compound48/80作用的MCs残余物组分别与DMEM组相比,差异具有显著性(p<0.05)。
　　(2)Compound48/80刺激的MCs促进 VSMCs发生迁移,其中MCs的颗粒释放液是 MCs促进VSMCs迁移的主要原因:MCs+Compound48/80组,Compound48/80刺激的MCs的颗粒释放液组和Compound48/80刺激的MCs的残余物组与DMEM+Compound48/80组相比,差异具有显著性(p<0.05);Compound48/80刺激的MCs的颗粒释放液组和Compound48/80刺激的MCs的残余物组相比,差异具有显著性(p<0.05)。
　　3.FITC标记的鬼笔环肽观察VSMCs微丝结构的改变,结果显示:
　　(1)MCs组与对照组相比,VSMCs微丝纤细,稀疏,荧光强度降低,应力纤维部分解聚。
　　(2)MCs颗粒释放液组的VSMCs微丝明显变细,稀疏,密度降低,荧光强度明显降低,细胞外周的应力纤维解聚,中央微丝束明显增加。
　　结论:
　　(1)Compound48/80和富马酸酮替芬对ApoE-/-小鼠血脂含量无明显影响, Compound48/80促进ApoE-/-小鼠的胸主动脉AS斑块的形成,而富马酸酮替芬对ApoE-/-小鼠的胸主动脉AS斑块具有一定抑制作用。
　　(2)MCs能促进VSMCs发生迁移,Compound48/80刺激的MCs能明显促进VSMCs发生迁移,其中MCs的颗粒释放液是MCs促进VSMCs发生迁移的主要原因。
　　(3)MCs颗粒释放液促进 VSMCs细胞骨架微丝重排,VSMCs迁移能力增加。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

1 前言

2 实验材料

2.1实验动物及主要试剂

2.2 主要仪器

3 实验方法

3.1动物部分

3.1.1 动物饲养

3.1.2 实验分组

3.1.3 取材与固定

3.1.4 苏丹Ⅳ大体染色

3.1.5 全自动生化分析仪测定血清中脂质含量

3.1.6 石蜡切片制作

3.1.7 苏木素－伊红染色

3.2 细胞部分

3.2.1 大鼠VSMCs原代培养

3.2.2 倒置相差显微镜观察

3.2.3大鼠主动脉平滑肌细胞α-actin染色

3.2.4 大鼠腹腔MCs采集分离

3.2.5 MCs颗粒释放液的提取

3.2.6 甲苯胺蓝染色

3.2.7荧光分光光度仪检测组胺释放率

3.3 实验分组

3.3.1大鼠VSMCs的 Transwell迁移实验分组：

3.3.2 VSMCs微丝染色的实验分组

4 实验结果

4.1动物部分

4.1.1 Compound 48/80对ApoE-/-小鼠血脂含量无明显影响

4.1.2 苏丹Ⅳ大体染色结果

4.1.3 Compound 48/80促进ApoE-/-小鼠胸主动脉斑块形成

4.2 细胞部分

4.2.1 倒置相差显微镜下观察 V S M C s 的形态

4.2.2 α–Actin 对大鼠 VSMCs 进行鉴定

4.2.3 Compound 48/80 对大鼠腹腔 MCs 脱颗粒的影响

4.2.4 MCs 对 VSMCs 迁移影响的研究

3.5 平滑肌细胞微丝的 FITC 标记的鬼笔环肽染色结果

3.5.1 MCs 对 VSMCs 微丝的作用：

3.5.2 Compound 48/80 刺激的 MCs 对 VSMCs 微丝的变化

4讨论

结论

参考文献

主要英文缩略语索引

综述

致谢