单纯疱疹病毒1型ICP0真核载体的构建及其对巨噬细胞分泌活性的影响

摘要

目的:构建ICP0真核表达载体pEGFP/ICP0,转染巨噬细胞,检测ICP0在巨噬细胞中的表达与定位。研究GFP-ICP0融合蛋白瞬时高表达对激活巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α以及NO的影响,为进一步探讨ICP0的致病性提供一定的实验依据。
　　方法:限制性内切酶双酶切质粒 PT7-110,将目的基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,构建 ICP0真核表达载体 pEGFP/ICP0。转染至巨噬细胞后,荧光显微镜观察ICP0在巨噬细胞中的定位,western blotting检测ICP0蛋白的表达。用TNF-α和IL-1β定量试剂盒检测LPS激活的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的水平,用Griess试剂测定经刺激后的小鼠巨噬细胞产生的NO水平。
　　结果:限制性内切酶双酶切质粒 PT7-110,将该目的片断亚克隆至真核载体pEGFP-C1上,所构建的真核表达载体pEGFP/ICP0转染巨噬细胞,荧光显微镜观察GFP-ICP0融合蛋白定位于细胞核,western blotting结果表明 pEGFP/ICP0可以在真核细胞中表达大小约为107KD的GFP-ICP0融合蛋白。转染24h后的细胞加入终浓度为100ng/mL的LPS诱导,分别收集诱导后12h、24h、48h细胞培养上清,ELISA法检测上清中细胞因子TNF-α、IL-1β含量的变化,Griess试剂测定上清液中的NO水平。结果表明,GFP-ICP0融合蛋白瞬时表达可上调LPS诱导的巨噬细胞细胞因子TNF-α、IL-1β以及NO的分泌,与各对照组比较,结果有显著性差异(采用方差分析, P<0.05)。
　　结论:1.成功构建了pEGFP/ICP0真核表达载体,GFP-ICP0融合蛋白成功表达并定位于细胞核;
　　2.GFP-ICP0融合蛋白瞬时表达上调 LPS诱导巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β;
　　3.GFP-ICP0融合蛋白瞬时表达上调LPS诱导巨噬细胞分泌NO。

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前言

第一部分 ICP0真核表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达与定位

实验材料

实验方法

实验结果

第二部分 GFP-ICP0融合蛋白对巨噬细胞分泌活性的影响

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢