酵母菌中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建

摘要

该研究旨在利用基因工程技术,研究磷酸-6-海藻糖合酶(TPS1)基因在大肠杆菌中的克隆与表达,对进一步构建海藻糖的高产基因工程菌株打下基础,所以该研究的主要目标就是,构建一个包含强启动子的高效表达载体,使磷酸-6-海藻糖合酶基因在大肠杆菌中高效表达.该研究根据Genebank发表的酿酒酵母磷酸-6-海藻糖合酶基因序列,设计了一对引物,以该实验室分离并诱变所得的一株高产海藻糖酵母菌提取的总RNA为模板,应用反转录PCR(RT-PCR)的方法,扩增出了TPS1基因序列.将扩增出的基因与T载体连接,用这个重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,使目的基因在受体菌中得到了复制,提取此重组菌的质粒酶切和PCR鉴定,证明了目的基因已经克隆入该受体大肠杆菌DH5α中,过夜培养含有重组质粒的阳性菌,加入甘油至终浓度为20％保存.在进行克隆试验过程中,在提取酵母总RNA时对当前流行的Trizol一步RNA提取法进行了改造,使之更适合于酵母RNA的提取,且提取的RNA在纯度和完整性方面大大提高.在进行RT-PCR过程中,针对几个对PCR反应影响比较大的因素设计了正交实验进行了反应条件的优化,最终确定的各因素加入量分别为Taq酶1.5u,模板10ng,dNTP(10mmol/L)1μl,上、下游引物各60pmol,镁离子终浓度为2.5mmol/L.反应条件为94℃,50s 58~52℃,1min30s 72℃,2min共30个循环,最后一个循环72℃,10min.由T载体和目的基因构成的重组质粒用Bam HI和PstⅠ双酶切之后,定向插入用这同样两种酶切的表达载体pUC18中,构建出表达载体pHY01,同样方法用Sac I和Bam HI双酶切重组质粒和pET-28a载体,并重新连接,构建出表达载体pHY02,两种表达载体经PCR反应和酶切反应鉴定后,都证明目的基因成功与载体连接.综上,该研究为最终构建高产海藻糖的基因工程大肠杆菌的目标打下了坚实的基础.

目录

文摘

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第一章前言

1.1海藻糖的理化性质

1.2海藻糖的生物学功能

1.3海藻糖合成途径及其相关基因

1.4海藻糖的应用

1.5海藻糖分子生物学研究进展及本研究的意义

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2试剂

2.1.3引物

2.1.4培养基

2.1.5主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1实验用品的处理

2.2.2酵母总RNA的快速提取方案

2.2.3经典总RNA提取方案

2.2.4甲醛变性电泳检测总RNA的完整性

2.2.5 RT-PCR体外扩增TPS1基因

2.2.6PCR产物的回收及纯化

2.2.7 PCR纯化产物与pUCm-T克隆载体连接

2.2.8感受态细胞的制备

2.2.9重组质粒转化感受态细胞

2.2.10 α-互补筛选

2.2.11重组质粒的小量提取

2.2.12质粒酶切鉴定

2.2.13酶切产物的纯化及表达载体的构建

2.2.14菌体总蛋白的提取

2.2.15海藻糖的提取

2.2.16海藻糖的测定方法

第三章结果与分析

3.1 RNA完整性与纯度分析

3.1.1 RNA实验用品的处理对RNA完整性的影响

3.1.2两种RNA提取方法完整性与纯度比较分析

3.1.3甲醛变性电泳检测总RNA的完整性

3.2 RT-PCR体外扩增TPS1基因

3.2.1引物的设计

3.2.2 PCR反应条件的优化

3.3目的基因与T载体连接与重组质粒的提取鉴定

3.3.1目的基因与T载体连接

3.3.2 PCR鉴定

3.3.3酶切鉴定

3.3.4测序分析

3.4 TPS1基因的表达

3.4.1高效表达载体的构建

3.4.2两种重组载体表达性能比较

3.4.3不同IPTG浓度对pHY02载体表达的影响

3.5海藻糖的测定结果

3.6讨论

第四章结论

参考文献

附录

致谢