铜对猪肝细胞CuZn-SOD酶活性及mRNA表达的影响

摘要

该试验以初生1日龄健康军牧1号仔猪为试验动物,研究不同铜浓度对CuZn-SOD酶活性及mRNA表达的影响.实验一利用24孔细胞培养板培养细胞,细胞培养液中添加10％牛血清,同时分别添加0、15.6、31.2、46.8、62.4、78、93.6μmol/LCu,观察细胞形态,测定细胞培养液中CuZn-SOD酶活性.结果显示:各个试验组的酶活性均显著增加,62.4μmol/Lcu时酶的活性最高(P<0.05).实验二利用RT-PCR方法测定肝细胞CuZn-SODmRNA表达量.细胞培养液中添加10％小牛血清,同时分别添加0、31.2、62.4、93.6 μmol/LCu,利用Trizol法从肝细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出SODcDNA,与pGEM-T载体相连接,转化大肠杆菌JM109,通过PCR鉴定及测序分析,证明所扩增DNA片段为目的片段.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,用β-actin作内参,用凝胶成像分析仪检测SODmRNA的相对表达量.结果显示,SODcDNA序列与基因库中的相一致,重合性达98.8％.细胞培养液中添加31.2、62.4、93.6μmol/LCu,肝细胞中SODmRNA的表达量均显著高于对照组(p<0.05),以62.4μmol/LCu组效果最为明显.从两个实验的结果我们可以推测,铜作为CuZn-SOD的活性中心,不仅可以直接提高SOD的酶活性,而且可以对其基因表达进行调控,提高转录水平,使SODmRNA表达量增加,为后期的翻译提供了条件,这对机体的抗氧化功能有重要意义,为铜的抗氧化机制提供了分子依据.

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文摘

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前 言

实验一铜对肝细胞CuZn-SOD酶活性的影响

1材料与方法

1.1材料

1.2试验方法

1.3统计分析

2结果

2.1肝细胞的培养及形态学观察

2.2铜水平与细胞培养液中超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)活性

3讨论

实验二铜对肝细胞CuZn-SODmRNA表达的影响

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果

2.1总RNA提取

2.2RT-PCR扩增产物电泳

2.3质粒的PCR鉴定

2.4核酸序列测定

2.5铜对SODmRNA表达的影响

3讨论

结论

参考文献

附录

致谢