钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22的克隆、表达及免疫保护性研究

摘要

目的:构建钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22基因的原核表达载体pQE31-Loa22,并在大肠杆菌M15中诱导表达目的蛋白。Loa22蛋白免疫豚鼠,研究其在豚鼠体内产生的的体液免疫和细胞免疫应答水平,并通过体内外试验检测其免疫保护性,为研制钩端螺旋体疫苗奠定实验基础。
　　方法:以赖型钩端螺旋体56601株基因组为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增大小为516 bp的目的基因片段。Loa22基因克隆至原核表达载体,构建pQE31-Loa22。重组质粒双酶切和测序鉴定。重组质粒转化入大肠杆菌 M15中诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blot鉴定目的蛋白。于0 w、2 w、4 w将蛋白及对照PBS分别经豚鼠腹股沟、腋下、背部多处免疫豚鼠。末次免疫后2 w,用培养7d的56601株钩端螺旋体从腹腔攻击各免疫组豚鼠(1mL/只)。连续观察15天,观察各免疫组豚鼠发病情况,并取各免疫组豚鼠的肺、肝、肾做病理切片,HE染色观察比较各免疫组豚鼠的组织病理变化。分析蛋白Loa22对豚鼠的免疫保护作用。ELISA法测定各免疫组豚鼠血清中抗体水平。无菌分离豚鼠脾淋巴细胞,MTT比色法检测各免疫组豚鼠脾淋巴细胞的体外增殖反应,计算刺激指数。ELISA测定Loa22蛋白抗血清与致病性钩端螺旋体56607、56603、56609株的交叉免疫反应。通过Fontana镀银染色法检测Loa22蛋白抗血清对钩端螺旋体56601株黏附Raw264.7细胞的阻断情况。
　　结果:PCR扩增出为516bp的目的片段。重组质粒经测序和双酶切鉴定构建成功。重组质粒转化入 M15后,SDS-PAGE、Western-blot检测目的基因能表达 Mr为22KD的蛋白。豚鼠接种Loa22蛋白后产生了特异性抗体,末次免疫后2 w豚鼠血清抗体最高滴度均达到了1:8000,而接种PBS的豚鼠血清中无特异性抗体。蛋白免疫组豚鼠脾淋巴细胞在体外经蛋白刺激后刺激指数(3.25±0.37)明显高于 PBS对照组(1.38±0.13)。Loa22蛋白免疫的豚鼠用56601株钩体攻击,经实验观察无发病现象,HE染色显示各组织没有病理改变。而PBS免疫的豚鼠在实验中不同程度的出现食欲不振、活动减少等现象,HE染色显示各组织均有明显的病理改变。Loa22蛋白抗血清与致病性钩体56607、56603和56609株具有良好的交叉免疫反应(效价为1/409600、1/819200、1/3376800)。Loa22蛋白抗血清稀释比率为1:50时黏附抑制率为90％,稀释比率为1:400时黏附抑制率为50%。
　　结论:
　　(1)成功扩增了Loa22基因,并成功构建了原核表达载体pQE31-Loa22。并在大肠杆菌M15表达出Mr约为22KD的重组蛋白。
　　(2) Loa22蛋白在豚鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答。
　　(3) Loa22蛋白在豚鼠体内诱生的免疫应答能抵抗同型钩体感染。
　　(4) Loa22蛋白抗血清与不同血清型钩体具有交叉免疫反应。
　　(5) Loa22蛋白抗血清能够阻断钩体黏附细胞。

目录

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主要缩略语英文索引

中文摘要

英文摘要

引言

实 验 材 料

1 主要仪器设备及材料

2主要实验试剂

实验方法及步骤

1 问号钩体赖株56601的培养

2 56601标准株基因组DNA的抽提

3 钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22基因的PCR扩增及琼脂糖电泳鉴定

4 pQE31-Loa22原核表达载体的构建及鉴定

5 Loa22重组蛋白（rLoa22）在E.coliM15中的诱导表达与鉴定

6 rLoa22纯化

7 Loa22蛋白的免疫保护性作用的研究

实 验 结 果

1 pQE31-Loa22原核表达载体的构建及鉴定

2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达和鉴定

3 Loa22蛋白在豚鼠中免疫活性的研究结果

4 Loa22蛋白抗血清与各株钩体抗原的交叉免疫反应

5 体外保护性试验

讨论

结论

参考文献

附录

文献综述

研究成果及发表论文

致谢