发夹式siRNA慢病毒表达载体构建及对人SR-PSOX基因表达的影响

摘要

目的:SR-PSOX/CXCL16是近年来新发现的一种趋化因子,与动脉粥样硬化的发展密切相关,但其功能尚不明确。构建抑制人SR-PSOX基因表达的发夹式siRNA慢病毒表达载体,建立利用RNA干扰技术研究人SR-PSOX基因功能的平台。
　　方法:在基因功能的研究领域,RNAi可特异、高效、快速地产生针对特定基因的沉默效应,被广泛应用于哺乳动物基因功能的研究。本研究通过Invitrogen公司专用软件对人SR-PSOX基因编码区分析,设计并合成shRNA单链。通过T4连接酶将退火反应合成的shRNA双链克隆入含RNA PolⅢ聚合酶表达元件的pENTRTM/U6入门载体,通过基因克隆技术构建靶向人SR-PSOX基因的发夹式siRNA(shRNA)入门载体,测序正确后使用LR重组技术构建相应的shRNA慢病毒表达载体,PCR鉴定挑选得到正确重组子,脂质体介导转染法将shRNA慢病毒表达载体包装入病毒宿主293FT细胞,72h后收集含假病毒颗粒的上清液,体外直接感染表达人SR-PSOX基因的人肝癌细胞株(HepG2)。通过RT-PCR、间接免疫荧光法及Western印迹法检测人SR-PSOX基因的表达水平。
　　结果:成功地构建了靶向人SR-PSOX基因的发夹式siRNA慢病毒表达载体;shRNA慢病毒表达载体可使人SR-PSOX基因的mRNA和蛋白表达量显著下降,抑制率达到80％,可在培养细胞中有效地沉默人SR-PSOX基因。
　　结论:成功构建出靶向人SR-PSOX基因的shRNA慢病毒表达载体,该表达载体可以在培养细胞中有效地沉默人SR-PSOX基因,从而为利用RNA干扰技术研究该基因的功能奠定了基础。

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主要英文缩略语

前言

材料与方法

1．材 料

1.1主要设备器材

1.2主要细胞株及试剂（盒）

1.3主要溶液配制

2. 方 法

2.1实验路线图

2.2 细胞培养

2.3 建立SR-PSOX—pENTRTM/U6入门载体

2.4 建立SR-PSOX—shRNA慢病毒表达载体

2.5 SR-PSOX—shRNA慢病毒表达载体293FT细胞内的包装与生产

2.6 病毒滴度的测定

2.7 实验分组

2.8 RT-PCR 检测抑制效应

2.9 间接免疫荧光法检测抑制效应

2.10 Western blot 蛋白水平检测抑制效应

3. 统计分析

结果

1. SR-PSOX—shRNA入门载体及慢病毒表达载体构建及鉴定

2. SR-PSOX—shRNA慢病毒表达载体的包装及293F细胞形态学变化

3. SR-PSOX—shRNA载体对SR-PSOX mRNA表达的影响

4. SR-PSOX—shRNA载体对SR-PSOX 蛋白表达的影响

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间所发表的文章

致谢