LCRG1基因启动子关键顺式调节元件的鉴定

摘要

目的：LCRG1基因(laryngeal carcinoma related genel，LCRG1)是一个新的喉癌候选抑瘤基因，其转录调控机制一直未被阐明。本研究拟阐明LCRG1基因转录调控机制的细节。 方法： (1)生物信息学分析预测LCRG1基因的启动子区域及核心启动子区域潜在的转录因子结合位点； (2)运用连接体扫描突变技术构建LCRG1启动子的突变质粒； (3)通过瞬时转染/体外双荧光素酶报告系统对这些重组质粒中的插入片段进行启动子活性分析； (4)真核表达质粒pcDNA3.1/Sp1和LCRG1基因启动子质粒连同PRL-TK共转染，检测SP1转录因子对LCRG1启动子活性的影响； (5)RT-PCR分析LCRG1基因在转染细胞系pcDNA3.1(+)/SP1/7721中的表达； (6)EMSA分析确认LCRG1基因调控区转录因子结合位点。 结果： (1)应用MatInspector软件预测结果显示，突变体3区域16bp内可能有4个转录因子结合位点，它们分别是ZF9，SP1，EKLF和RB_E2F1_DP1； (2)应用PCR搭桥突变的方法，以-169/+127这一启动子片断为基础，成功构建了17个突变体； (3)瞬时转染及荧光素酶报告基因活性检测分析发现LR3(-137/-122)所突变的这16bp所在部位可以认为是启动子转录所需的关键的调控元件区域； (4)共转染结果显示外源性的转录因子SP1对LCRG1启动子的活性有上调作用，且SP1的上调作用随SP1共转染量的加大而增强； (5)RT-PCR结果表明LCRG1基因在pcDNA3.1(+)/SP1/7721细胞中表达增高； (6)EMSA分析证实LCRG1基因调控区-137/-127能特异性地结合转录因子Sp1。 结论： (1)LCRG1基因转录起始点上游-137到-122的DNA片段是LCRG1基因启动子转录所需的关键调控元件区域； (2)外源性的转录因子SP1对LCRG1启动子的活性有上调作用，且SP1的上调作用随SP1共转染量的加大而增强； (3)LCRG1基因调控区-137/-127能特异性地结合转录因子Sp1。