菲立磁标记兔骨髓基质细胞自体移植坐骨神经的研究

摘要

目的：本课题拟在合适示踪剂帮助下，采用无创伤性影像学技术来在体识别、跟踪移植后骨髓基质细胞的存活状态及与宿主神经组织整合情况，从而了解骨髓基质细胞移植周围神经后细胞如何迁移、如何凋亡和如何被吸收以及被谁吞噬。 方法：骨髓基质细胞原代分离培养、诱导，菲立磁标记、鉴定以及传代后注人坐骨神经损伤的兔模型中，并在规定时间点进行磁共振、免疫组化、透射电镜等方法观察。具体方法：在无菌条件下取3月龄新西兰大白兔股骨的骨髓细胞做原代培养。根据骨髓基质细胞与其他细胞的密度不同而采用Percoll(比重1.077)分离液将其分离，此方法分离的间充质干细胞种类较为单一。原代细胞于含10％小牛血清的低糖DMEM培养液中进行培养传代。收集第三代细胞加入神经干细胞培养基及EGF(10ng/ml)+LIF(10ng/ml)+b-FGF(10ng/ml)+FBS(1％)，并进行菲立磁标记。用常规ABC法进行抗nestin免疫组织化学染色和普鲁士蓝(Prussian Blue)染色，分别鉴定神经干细胞和菲立磁标记的干细胞。成年新西兰大白兔12只，每只随机选择一侧坐骨神经为移植侧，另一侧为对照侧，用显微技术去除外膜内8mm长一段的神经，将经过上述标记处理的干细胞注射入移植侧神经缺损处，而对照侧则植入纯的培养液。于细胞移植后第1、2、4、8及16周分别行MRI、透射电镜及免疫组化检查。 结果： (1)分离得到的骨髓基质细胞在体外培养中能够迅速粘附，且可通过传代去除非粘附细胞进行培养。给予适当分化条件后可见这些细胞可形成细胞克隆团，经免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性，并逐渐出现出芽现象，然后逐渐形成细胞胞突并彼此发生联系，突起伸长连接成网呈典型的神经细胞形态，说明这些来源于骨髓基质的细胞有分化为神经元样或神经干细胞样细胞的趋向。 (2)菲立磁可以高效率的标记BMSCs，标记率在98％左右。以浓度25μg/ml标记的BMSCs与未标记细胞相比较，不同培养阶段的细胞形态学无明显变化。渗漏性分析表明共培养菲立磁标记干细胞普鲁士兰染色阳性，且未发现渗漏，说明标记后的细胞不存在菲立磁的渗漏。 (3)将菲立磁标记的干细胞移植后，采用MRI技术对兔坐骨神经进行扫描发现，以T1WI和T2WI序列检查可见移植FE-PLL标记干细胞的坐骨神经区有明显低信号改变，T2WI扫描序列信号较T1WI明显。细胞移植1周时信号改变区域比较局限，移植4和8周后信号区域改变增大。细胞移植1、4、8周时的组织学改变基本上与核磁共振影像相对应。体外菲立磁标记骨髓基质细胞经微移植后可在坐骨神经内存活，移植干细胞可向神经两端迁移。在透射电镜的超微结构水平时并没有发现Feridex标记的干细胞与宿主周围神经建立突触联系，但其分化为雪旺氏细胞后有突起与宿主周围神经相连接。 结论： (1)骨髓基质细胞在合适的体外培养条件下能够转化为神经干细胞，并保持增殖分化的能力。骨髓基质细胞源性神经干细胞能分化成具有神经系细胞特征的细胞，且可作为种子细胞进行神经移植实验研究。 (2)标记培养基Fe3+浓度为25ug/ml时，Feridex对BMSCs标记效率较高，且不影响其存活、增殖及分化的能力，标记后的BMSCs可用于进一步实验。为将来利用MRI非侵入技术活体追踪和定位移植后的神经干细胞提供了良好的技术平台。 (3)兔骨髓基质细胞源神经干细胞移植后，可在坐骨神经内存活、迁移、分化，T2WI序列成像可清晰显示Feridex标记的BMSCs所致的低密度影像改变。利用MRI可以对移植后的标记细胞进行初步活体追踪。